徐 巖，李 鑫，趙昕彤，楊明慧，劉玥欣，周 佳，葉豆丹*，黃曉巍,2*

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春 130117；2.吉林省中藥生物大分子重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130117）

輕度認(rèn)知功能障礙（mild cognitive impairment，MCI）是阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）發(fā)生發(fā)展的過渡態(tài)，早期干預(yù)是AD治療的關(guān)鍵因素[1]。而現(xiàn)代研究[2-4]表明，由大腦免疫系統(tǒng)引發(fā)的炎癥機(jī)制驅(qū)動(dòng)了AD的惡化，也就是說MCI的發(fā)展與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)息息相關(guān)。鹿茸含生發(fā)之氣，具有益精填髓之功效，可明顯改善機(jī)體的免疫功能，鹿茸多肽是其主要的藥效物質(zhì)[5]。解聚素和金屬蛋白酶10（A DisintegrinAnd Metalloproteinase 10，ADAM10）、β- 淀粉樣前體蛋白水解酶1（β-site APP cleavage enzyme-1，BACE-1）是MCI治療的潛在靶點(diǎn)[6-8]。本研究通過腹腔注射東莨菪堿復(fù)制MCI大鼠模型，觀察鹿茸多肽對(duì)模型大鼠海馬組織中ADAM10、BACE-1表達(dá)的影響，探討相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量（220±20）g，長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司，動(dòng)物許可證號(hào)碼：SCXK（吉）-2016-0003。

1.2 藥品與試劑 鹿茸多肽，由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)提供；吡拉西坦（東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20121775）；氫溴酸東莨菪堿（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號(hào)：D172511B）；ADAM10、BACE-1 Elisa kit（酶免生物科技有限公司， 貨 號(hào)：MM-0866R1、MM-43972M1）；AxyPrep總RNA小量制備試劑盒（美國(guó)Axygen公司，貨號(hào)：AP-UN-MS-RNA-50）；PrimeScript? RT Master Mix 和SYBR? Premix Ex Taq? II（大連寶生物工程有限公司，貨號(hào)：RR036A、RR82LR）。

1.3 儀器設(shè)備 Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司，型號(hào)：MT-200），Multiskan FC酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司），熒光定量PCR儀（美國(guó)Stratagene公司，型號(hào)：Mx3000），凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó) Aplegen公司，型號(hào)：Omegalum C）。

1.4 動(dòng)物分組及給藥 60只大鼠隨機(jī)分為6組，即空白對(duì)照組，模型組，陽性對(duì)照組，鹿茸多肽高、中、低劑量組，每組10只。空白對(duì)照組、模型組給予等容積蒸餾水，陽性對(duì)照組給予吡拉西坦500 mg/kg，鹿茸多肽高、中、低劑量組大鼠分別給予鹿茸多肽300 mg/kg、200 mg/kg、100 mg/kg，連續(xù)給藥21 d。

1.5 MCI大鼠模型的制備 末次給藥結(jié)束后1 h，除空白組外一次性腹腔注射東莨菪堿復(fù)制MCI動(dòng)物模型。末次給藥結(jié)束后進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)觀察各組大鼠行為學(xué)變化。然后處死動(dòng)物，提取海馬組織樣品備用。

1.6 Morrios水迷宮空間探索實(shí)驗(yàn)[9]將大鼠從平臺(tái)所在象限對(duì)側(cè)面壁式入水，訓(xùn)練大鼠在2 min內(nèi)找到平臺(tái)，在平臺(tái)上保持5 s。若2 min仍未找到平臺(tái)，將大鼠引上平臺(tái)休息10 s，直至大鼠找到平臺(tái)為止，實(shí)驗(yàn)共計(jì)5 d。第6天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，撤去平臺(tái)，記錄2 min內(nèi)大鼠平臺(tái)穿越次數(shù)及有效區(qū)停留時(shí)間。

1.7 ELISA法檢測(cè)各組大鼠海馬組織中ADAMl0和BACE-1的含量 收集各組大鼠海馬組織，按Elisa kit說明書檢測(cè)各組大鼠海馬組織中ADAMl0和BACE-1的含量，測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處吸光度（A）值。

1.8 RT-PCR法檢測(cè)各組大鼠海馬組織中ADAMl0和BACE-1的mRNA表達(dá)水平 提取各組大鼠海馬組織中總RNA后將mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA（反應(yīng)條件：37 ℃孵育60 min，85 ℃孵育5 min，冰浴5 min）；再通過PCR擴(kuò)增儀，以cDNA為模板，獲得目的基因，PCR反應(yīng)體系：模板1 μL、上游引物（10 μm/μL）1 μL、下游引物（10 μm/μL）1 μL、2×Taq PCR Master Mix12.5 μL、DDH2O 9.5 μL，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸5 min，4℃保存。內(nèi)參β-actin的引物，上游 序 列：5’-GGGTGTGATGGTGGGAATGG-3’，下 游 序 列：5’- TGTAGAAGGTGTGGTGCCAG-3’（150 bp）；目的基因ADAM10的引物，上游序列：5’-AACACGAGAAGCTGTGATTGC-3’， 下 游 序列：5’-CGGAGAAGTCTGTAGTCTGGTAAA-3’（79 bp）；BACE-1引 物 序 列： 上 游 引 物5’-GGCGGGAGTGGTATTATGAA-3’，下游引物：5’-CACTGTCCACGATGCTCTTGT-3’（107 bp）。采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析，通過凝膠成像系統(tǒng)，分析結(jié)果，以目的基因與內(nèi)參β-actin的灰度值之比表示mRNA轉(zhuǎn)錄水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（± s）表示，多組均數(shù)組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Morrios水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果 Morrios水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白對(duì)照組比較，模型組平臺(tái)穿越次數(shù)及有效區(qū)停留時(shí)間明顯減少（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對(duì)照組、鹿茸多肽高、中劑量組平臺(tái)穿越次數(shù)明顯延長(zhǎng)（P＜0.05或P＜0.01），陽性對(duì)照組和鹿茸多肽高劑量組有效區(qū)停留時(shí)間明顯增加（P＜0.05），見表1。

表1 各組Morrios水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果（± s ，n = 10）

表1 各組Morrios水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果（± s ，n = 10）

注：與空白對(duì)照組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，# P＜0.05，## P＜0.01

組 別 平臺(tái)穿越次數(shù)/次 有效區(qū)停留時(shí)間/s空白對(duì)照組 6.50±1.58 60.38±19.69模型組 3.80±0.79△△ 32.35±10.25△△陽性對(duì)照組 5.30±1.35## 50.26±18.38#鹿茸多肽高劑量組 4.80±1.02# 48.15±15.28#鹿茸多肽中劑量組 4.70±0.96# 40.39±11.16鹿茸多肽低劑量組 3.92±1.08 34.60±9.36

2.2 各組海馬組織中ADAMl0和BACE-1含量 Elisa檢測(cè)結(jié)果表明，與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠海馬組織中ADAM10含量明顯降低，BACE-1含量明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，陽性對(duì)照組大鼠海馬組織中ADAM10含量有所升高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），BACE-1明顯降低（P＜0.05），鹿茸多肽高、中、低劑量組ADAM10含量明顯升高，BACE-1含量明顯降低（P＜0.05），見表2。

表2 各組海馬組織中ADAMl0和BACE-1含量比較（± s ，n = 10）

表2 各組海馬組織中ADAMl0和BACE-1含量比較（± s ，n = 10）

注：與空白對(duì)照組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，# P＜0.05，## P＜0.01

組 別 ADAMl0/ng/L BACE-1/ng/L空白對(duì)照組 126.65±20.38 126.65±20.38模型組 95.25±17.38△△ 165.35±35.62△△陽性對(duì)照組 102.07±16.52 133.68±23.06#鹿茸多肽高劑量組 110.57±12.96# 132.20±18.02#鹿茸多肽中劑量組 113.35±15.96# 140.16±12.50#鹿茸多肽低劑量組 118.34±22.18# 136.06±20.65#

2.3 各組海馬組織中ADAMl0和BACE-1的mRNA表達(dá)水平 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，與空白對(duì)照組比較，模型組海馬組織中ADAM10mRNA表達(dá)水平明顯降低，BACE-1 mRNA表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組比較，陽性對(duì)照組海馬組織中ADAM10含量有所升高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），BACE-1明顯降低（P＜0.05），鹿茸多肽高、中、低劑量組ADAM10含量明顯升高，BACE-1含量明顯降低（P＜0.05或P＜0.05）。見表3、圖1。

表3 各組海馬組織中ADAMl0和BACE-1的mRNA表達(dá)水平（± s ，n = 10）

表3 各組海馬組織中ADAMl0和BACE-1的mRNA表達(dá)水平（± s ，n = 10）

注：與空白對(duì)照組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，# P＜0.05，## P＜0.01

組 別 ADAMl0 BACE-1空白對(duì)照組 0.40±0.12 0.28±0.06模型組 0.21±0.09△△ 0.41±0.13△△陽性對(duì)照組 0.26±0.06 0.30±0.09#鹿茸多肽高劑量組 0.58±0.15## 0.25±0.10##鹿茸多肽中劑量組 0.43±0.14## 0.22±0.08##鹿茸多肽低劑量組 0.57±0.18## 0.33±0.07#

圖1 各組海馬組織中ADAMl0和BACE-1 mRNA表達(dá)電泳圖

3 討論

伴隨著全球人口老齡化的趨勢(shì)加劇，AD的病發(fā)率直線上升，仍現(xiàn)代醫(yī)學(xué)缺乏有效的治療手段。受限于AD病程的不可逆性，在MCI階段給予適當(dāng)?shù)母深A(yù)是目前臨床常用的治療思路[10-12]。中醫(yī)腦髓理論[13-14]認(rèn)為：“腎藏精，主骨生髓，腦為髓海，年邁體弱，久病及腎，腎精虧虛，髓海失充，腦萎髓空，腦失所養(yǎng)，神機(jī)失用而出現(xiàn)呆證”。鹿茸歸肝、腎經(jīng)，具有壯腎陽、益精血、強(qiáng)筋壯骨等功效，是中醫(yī)臨床上治療腦病的代表藥物。近現(xiàn)代中國(guó)中醫(yī)學(xué)界的醫(yī)學(xué)泰斗張錫純?cè)凇夺t(yī)學(xué)衷中參西錄》中寫到：“人之色欲過度者，其腦髓必空，人之腦髓空者，其人亦必頭重目眩，甚或猝然昏厥，知覺運(yùn)動(dòng)俱廢，因腦髓之質(zhì)原為神經(jīng)之本源也。治之者，宜用峻補(bǔ)腎經(jīng)之劑，加鹿角膠以通督脈”[15]。

ADAM10是解聚素和金屬蛋白酶家族的重要一員，參與調(diào)節(jié)諸多疾病的發(fā)生、發(fā)展，通過其調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附及金屬蛋白酶酶解的作用可以有效地遏制AD進(jìn)程[16-17]。BACE-1是Aβ產(chǎn)生過程的關(guān)鍵酶，現(xiàn)代研究[18-20]表明，BACE-1的過表達(dá)將直接導(dǎo)致Aβ沉積，是誘發(fā)AD的關(guān)鍵靶點(diǎn)。通過基因敲除手段或使用siRNA干擾、BACE-1抑制劑是阻滯Aβ沉積的有效手段，但現(xiàn)代研究多停留在實(shí)驗(yàn)室階段，相關(guān)技術(shù)還不成熟，無法滿足臨床應(yīng)用的需求，因此發(fā)揮中醫(yī)藥特色，探尋具有改善認(rèn)知功能障礙作用的中藥對(duì)于MCI患者意義重大。

鹿茸的臨床應(yīng)用秉承中醫(yī)的整體觀，本研究以鹿茸的主要藥效物質(zhì)鹿茸多肽為研究對(duì)象，驗(yàn)證其可通過“填精補(bǔ)髓”作用發(fā)揮促智并改善機(jī)體記憶障礙的功效。研究結(jié)果表明，鹿茸多肽可以提高氫溴酸東莨菪堿所致的MCI模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，其作用機(jī)制與提高海馬組織中ADAM10mRNA表達(dá)水平，抑制BACE-1 mRNA表達(dá)有關(guān)。