楊小頎，馬雁南，馬曉軍，胥 冰

（1.陜西中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院生殖科，陜西 咸陽 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學，陜西 咸陽 712046；3.寶雞市第二中醫(yī)醫(yī)院婦產科，陜西 寶雞 721300）

復發(fā)性流產（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指與同一性伴侶連續(xù)發(fā)生至少2次以上的妊娠不足20周胎兒（體質量≤500 g）丟失的病理現(xiàn)象[1]，發(fā)病率約占妊娠女性總數(shù)1%～5%。隨著生殖免疫研究的精準化深入，探索RSA病因研究逐步聚焦到母-胎界面免疫耐受的調節(jié)機制上來[2]。正常妊娠時，母體免疫系統(tǒng)對胚胎遺傳的父系抗原存在免疫保護和支持，也正是依賴于這一保護性的免疫耐受機制的建立和維持，才得以保證正常妊娠過程序貫進行。而一旦這種耐受機制失調，母胎界面免疫微環(huán)境中CD4+T細胞代表的輔助型T細胞明顯強于CD8+T細胞代表的抑制型T細胞時，將導致免疫損傷，即打破經典Th1/Th2平衡理論，致使胚胎丟失，亦即發(fā)生流產行為[3]。

黃芩（Scutellaria Baicalensis）初載于《本經》，其性涼味苦，具有清熱安胎的作用[4-6]。中藥安胎歷史悠久，黃芩亦在諸多安胎方劑中出現(xiàn)并沿用至今，其主要成分之一黃芩苷的安胎效果已被臨床實踐所證實[7-9]，但其是否在子宮微環(huán)境中促進母胎免疫耐受調節(jié)機制的建立，進而有效制約RSA的發(fā)生，目前尚不明確，故具有研究意義。本實驗選用國際公認的復發(fā)性流產小鼠模型[10-12]，在黃芩苷干預下分別經免疫組化方法檢測子宮組織中CD4+和CD8+T細胞的含量；ELISA檢測子宮組織中IFN-γ及IL-4的含量，并對比統(tǒng)計分析，旨在研究黃芩苷是否通過調節(jié)子宮局部母-胎界面免疫耐受建立和維持來發(fā)揮安胎作用，從免疫學角度來探討黃芩苷的安胎機理，為中醫(yī)學中黃芩“清熱安胎”理論提供確鑿科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及處理 1）模型處理及分組：8周齡SPF級CBA/J雌鼠30只，體重20～22 g，DBA/2雄鼠10只，BALB/C雄鼠5只，由上海西普爾必凱實驗動物有限公司提供，許可證號SCXK（滬）2013-0016。常規(guī)飼養(yǎng)，自由采食飲水。經觀察臨床健康，適應環(huán)境1周后，公母鼠交換墊料，1～2 d后肉眼觀察結合陰道涂片法檢查母鼠發(fā)情情況。將發(fā)情的CBA/J雌鼠，與DBA/2雄鼠按2：1比例合籠交配，制造復發(fā)性流產模型；與BALB/C雄鼠按2:1比例合籠，制造正常妊娠模型。次晨檢出陰栓者，記為孕0 d。試驗動物分為正常妊娠組（A組：CBA/J雌鼠與BALB/C雄鼠交配）和試驗組（CBA/J雌鼠與DBA/2雄鼠交配制造的復發(fā)性流產模型），試驗組隨機分為模型對照組（B組）和黃芩苷治療組（C組）。A組自孕1 d開始連續(xù)灌胃（磷酸鹽緩沖液0.4 mL/d/只），共14 d。B組均自孕1 d開始連續(xù)灌胃（磷酸鹽緩沖液0.4 mL/d/只），共14 d；C組自孕1 d開始連續(xù)灌胃黃芩苷液，共14 d（黃芩苷0.4 mL/mg/d/只），藥物劑量參考常用最佳量為試驗藥物劑量[13-14]。孕14 d處死所有孕鼠。3）實驗取材：孕滿14 d處死所有孕鼠，打開腹腔，暴露子宮，觀察子宮生長情況，記錄胚胎著床數(shù)目和胚胎吸收數(shù)目。而后在冰盒上完整取出子宮，除去系膜及脂肪組織后稱重?？v向剖開子宮，完整剝離胚胎后稱量子宮凈重。剪下右側子宮，稱重后加入pH =7.4磷酸鹽緩沖液（內含6倍量0.75 ug/mg的蛋白酶抑制劑），立即在低溫環(huán)境中進行勻漿，4 ℃，12 000 r.p.m.離心15 min。取上清液分裝，- 80℃凍存，用于ELSIA測定INF-γ、IL-4的含量。左側子宮剪下后立即進行免疫組織化學染色。

1.2 試劑及藥品 黃芩苷（Baicalin），購于博奧生物醫(yī)藥科技有限公司；蛋白酶抑制劑（Aprotinin），Biosharp產品。小鼠INF-γ、IL-4免疫因子ELISA測試盒。大鼠抗小鼠CD4+/CD8+單克隆抗體，Serotec產品。

1.3 免疫組化測定CD4+、CD8+T淋巴細胞 1）石蠟切片脫蠟至水：二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水。2）去除內源性過氧化酶：3%H2O2，室溫孵育8 min，PBS沖洗。3）抗原修復：熱抗原修復，96 ℃，12 min，以修復抗原。4）石蠟切片非特異性IgG的封閉與阻斷：滴加封閉用正常山羊血清工作液，室溫孵育30 min。5）分別滴加大鼠抗小鼠CD4+、CD8+單克隆抗體，用PBS取代一抗作陰性對照，4 ℃冰箱中過夜。6）滴加生物素標記兔抗大鼠IgG，37 ℃孵育30 min。PBS沖洗，5 min×3次。7）滴加辣根酶標記鏈親合素工作液，37 ℃孵育30 min。PBS沖洗，5 min×3次。8）DAB顯色：避光鏡下顯色，水洗終止反應。9）脫水、封片：梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.4 ELISA法檢測IFN-γ、IL-4細胞因子含量 根據試劑盒說明書操作，反應終止后，在酶標儀450 nm波長處讀取OD值，利用已知濃度的標準樣品OD繪制標準曲線，據此標準曲線計算IFN-γ、IL-4細胞因子的含量。

1.5 統(tǒng)計分析 所有數(shù)據使用Excel 2000和SPSS 13.0軟件包進行統(tǒng)計，單變量方差分析組間差異顯著性。試驗數(shù)據以均數(shù)±標準差（± s ）表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結果

2.1 各組用藥及胚胎流產率、吸收率比較 見表1。

2.2 各組子宮組織中IFN-γ、IL-4細胞因子含量比較 見表2。

2.3 各組子宮組織中CD4+、CD8+T細胞含量比較 見表3。

表1 各組用藥及胚胎流產率、吸收率比較（n = 10）

表2 各組子宮組織中IFN-γ、IL-4細胞因子含量比較（± s，n = 10）

表2 各組子宮組織中IFN-γ、IL-4細胞因子含量比較（± s，n = 10）

注：與A組比較，## P＜0.01；與B組比較，# P＜0.05

組 別 IFN-γ子宮勻漿/（pg/mL） IL-子宮勻漿/（pg/mL） IFN-γ/IL-4（Th1/Th2）A 組 15.091±9.8753 25.558±8.0332 0.743±0.023 B組 36.107±32.7831 ## 9.853±11.5074 ## 3.225±0.018 C組 9.866±11.1540 # 33.227±16.3209 # 0.423±0.069##

表 3 各組子宮組織中CD4+、CD8+T細胞含量比較（± s ，n = 10）

表 3 各組子宮組織中CD4+、CD8+T細胞含量比較（± s ，n = 10）

注：與A組比較，## P＜0.05；與B組比較，# P＜0.05

組 別 CD4+T淋巴細胞 CD8+T淋巴細胞 CD4+/CD8+A 組 4.801±0.327 13.184±0.831 0.365±0.089 B組 28.998±2.176## 10.059±1.574## 2.679±0.070 C組 5.011±0.423# 15.869±0.725# 0.327±0.067##

2.4 CD4+/CD8+比與Th1/Th2的關系 C組的CD4+/CD8+T比值及Th1/Th2比值均與A組近似，差異無統(tǒng)計學意義，但較B組差異均極明顯。B組中CD4+/CD8+比值和Th1/Th2比值均升高（P＜ 0.01）。

a．正常妊娠小鼠子宮內膜中CD4+T細胞量少，脫膜細胞多，→CD4+T細胞；b.對照組小鼠子宮內膜CD4+T細胞數(shù)量增多，蛻膜細胞明顯減少，→CD4+T細胞；c.黃芩苷治療組小鼠子宮內膜中CD4+T細胞量少，蛻膜細胞多，→CD4+T細胞；d.正常妊娠小鼠子宮內膜中CD8+T細胞多，蛻膜細胞多，→CD8+T細胞；e. 對照組子宮內膜中CD8+T細胞減少，蛻膜細胞明顯減少，→CD8+T細胞；f.黃芩苷治療組小鼠子宮內膜CD8+T細胞明顯增多，蛻膜細胞豐富，→CD8+T細胞。

3 結論

RSA的高發(fā)生率和高危害性已嚴重影響育齡女性生殖生育健康，被社會廣泛關注，RSA與免疫因素密切相關[15-17]。T淋巴細胞是一種調節(jié)母-胎免疫耐受狀態(tài)的重要細胞群，CD4+、CD8+T細胞又是其中2類重要的T淋巴細胞亞群[18]。CD4+T細胞在母胎微環(huán)境中發(fā)揮免疫放大效應，加強母體對胚胎的免疫毒性作用；而CD8+T細胞發(fā)揮負性調節(jié)作用，使胚胎減少母體免疫攻擊性損傷，即對母體免疫產生耐受行為，一旦CD4+/CD8+T比例異常，免疫耐受失衡，即導致RSA的發(fā)生[19]。以IFN-γ為代表的Th1型細胞發(fā)揮著免疫排斥，是公認的攻擊型細胞；而以IL-4為代表的Th2型細胞，誘導母體對胎兒的免疫耐受反應建立。生理性妊娠過程中，Th1/Th2維持平衡狀態(tài)，而一旦比例失調，則會導致母胎微環(huán)境中免疫耐受減弱，復發(fā)性流產發(fā)生[20-22]。

本研究結果顯示，黃芩苷干預治療對復發(fā)性流產組子宮免疫微環(huán)境中CD4+T具有明顯抑制作用，對CD8+T具有促進作用，較好保證了免疫耐受狀態(tài)的維持，對降低流產率和胚胎死亡率具有正性調節(jié)作用。同時，對Th1細胞分泌攻擊型細胞因子具有抑制作用，對Th2細胞分泌保護性細胞因子具有促進作用，較好的維持了Th1/Th2平衡向Th2方向發(fā)生，并與CD4+/CD8+比呈一定正相關性，對 “安胎” 起到積極作用。