張 琳,高 勇

陜西省寶雞市婦幼保健院(寶雞 721000)

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，具有治療難度大、發(fā)病率高及死亡率高等特點。諸多研究結(jié)果表明，中醫(yī)藥對于肝癌等各種類型癌癥的治療具有確切的臨床療效[1-2]。復(fù)方紅豆杉膠囊是臨床常用的抗腫瘤中藥制劑，具有活血祛瘀、消腫散結(jié)等功效，主要用于非小細(xì)胞肺癌的輔助治療[3]。有研究結(jié)果表明，復(fù)方紅豆杉膠囊用于治療肝癌亦具有較好的療效，但該結(jié)論仍缺乏動物實驗及大樣本臨床觀察結(jié)果予以深入闡述，而對于藥物作用機制亦未進(jìn)行研究[4]。為此，本研究觀察了復(fù)方紅豆杉膠囊對Walker-256移植性肝癌大鼠肝組織中缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)等腫瘤缺氧微環(huán)境中主要細(xì)胞因子表達(dá)的影響，期望為復(fù)方紅豆杉膠囊用于肝癌的治療提供一定的實驗依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

材料與方法

1 動 物 清潔級SD雄性大鼠50只，體質(zhì)量180～220 g，另取清潔級斷奶SD雄性大鼠10只用于肝癌細(xì)胞的增殖傳代，體質(zhì)量60～80 g，每周進(jìn)行1次傳代，形成癌性腹水后制作腫瘤細(xì)胞懸液，用于移植性肝癌造模。所有大鼠均購于陜西省疾控中心實驗動物中心，并由該中心代飼養(yǎng)，動物生產(chǎn)合格證號: SCXK(陜)2017-0002。

2 實驗瘤株 本研究所用Walker-256癌肉瘤，購買自中國典型培養(yǎng)物保藏中心，并保存在陜西省疾控中心藥品評價中心-80℃冰箱。

3 儀器與試劑 Olympus 21型顯微照相系統(tǒng)(日本奧林匹斯公司)；BBS-DC型超凈化工作臺(上海安賽醫(yī)療器械有限公司)；AS-SA1型全自動血液分析儀(北京博大醫(yī)用器械公司)；5417R型冷凍離心機(德國Eppendorf實驗儀器公司)；NB-9型全自動多功能酶標(biāo)儀(美國天地公司)。兔抗HIF-1α、VEGF及PCNA抗體及檢測所需試劑盒(南京建成生物制品研究所)；蘇木素-伊紅溶液(美國sigma公司)；PBS磷酸鹽緩沖液(陜西安義生物制品有限公司)；復(fù)方紅豆杉膠囊(重慶賽諾生物藥業(yè)股份有限公司)。

4 分組、給藥及造模方法 將上述50只清潔級SD雄性大鼠隨機分為空白組、模型組、小劑量復(fù)方紅豆杉膠囊處理組、中劑量復(fù)方紅豆杉膠囊處理組和大劑量復(fù)方紅豆杉膠囊處理組，每組均為10只。依據(jù)文獻(xiàn)報道[5]，確定各組大鼠的給藥劑量，即大鼠給藥劑量(mg/kg)=成人劑量(mg/kg)×6.25，成人體質(zhì)量用60 kg計，復(fù)方紅豆杉膠囊的一般人體劑量為1.8 g/60 kg=0.03 g/kg，折合大鼠劑量則為0.03×6.25=0.1875 g/kg，故分別選取0.93 g/kg，0.1875 g/kg及0.37 g/kg為小劑量組、中劑量組及大劑量組的給藥劑量。

根據(jù)文獻(xiàn)方法[6]，對各組大鼠進(jìn)行肝癌模型造模：抽取5 ml二次傳代后的幼鼠癌性腹水，以高速離心機(1200 r /min；5 min)離心后棄去上清液，用生理鹽水洗滌下層瘤細(xì)胞1次，洗滌結(jié)束后以PBS溶液制備瘤細(xì)胞懸液備用。實驗用SD大鼠術(shù)前禁食禁水12 h，以40 mg /kg 劑量的2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，麻醉成功后均取仰臥位固定并采用碘酒消毒，沿腹白線自大鼠劍突下逐層切開約1.5 cm，暴露大鼠腹腔并托出肝左外葉，用0.25 ml 注射器抽取瘤細(xì)胞懸液0.05 ml(細(xì)胞計數(shù)約5×106個)，將針頭與肝臟表面呈30°角斜刺入除空白組外其余組大鼠肝左外葉約0.8 cm，將瘤細(xì)胞懸液緩慢注入，快速拔針并采用凝膠止血海綿填塞穿刺點15 s，無活動性出血后將肝臟還納于腹腔并縫合腹部傷口，空白組則注入等量生理鹽水，其余操作均與各組一致。術(shù)后肌肉注射青霉素[10 萬U/(只·d)]，連續(xù)注射3 d。于造模第7天，從各組分別隨機抽取2只大鼠處死并取肝臟，病理組織學(xué)檢查結(jié)果證實空白組肝臟均正常，而其余組則均成功造模，故本研究各組大鼠有效例數(shù)均為8例。于造模第8天開始，對低、中及高劑量組大鼠灌胃給予相應(yīng)劑量的復(fù)方紅豆杉膠囊，采用生理鹽水進(jìn)行溶解并配制為密度1.30g/ml的浸膏，1次/d，連續(xù)給藥21 d，空白組及模型組則僅給予等量生理鹽水。

5 標(biāo)本處理及檢測方法 于末次給藥24 h后，采用乙醚將大鼠麻醉，以腹主動脈取血法取5 ml血，以高速離心機(1200 r /min；5 min)分離血清，檢測其中肝功能指標(biāo)水平，主要包括天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、總膽紅素(TBIL)、白蛋白(ALB)及丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)。采取頸椎脫臼法將各組大鼠處死，解剖取肝臟癌組織(存在多個癌結(jié)節(jié)的取最大)，空白組則取針頭刺入部位肝組織，將其平均分為4部分，用10%甲醛溶液將其中1份固定，并進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋及切片處理，采用蘇木精-伊紅染色法進(jìn)行常規(guī)組織學(xué)觀察。其余三部分則采用常規(guī)脫蠟，以SP法檢測，抗HIF-1α、VEGF及PCNA抗體的工作濃度依次為1∶200、1∶300和1∶500，上述蛋白陽性表達(dá)依次為胞質(zhì)呈黃色顆粒、黃色細(xì)胞核染色及胞質(zhì)呈藍(lán)色顆粒，應(yīng)用Image-proplus 6.0軟件對上述蛋白陽性表達(dá)進(jìn)行半定量分析，并統(tǒng)計其相對表達(dá)量。

結(jié)果

1 各組大鼠肝功能比較 見表1。與模型組相比較，空白組、小劑量、中劑量和大劑量復(fù)方紅豆杉膠囊處理組大鼠血清ALB含量明顯增高，而AST、TBIL及ALT含量則均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與空白組相比較，小劑量、中劑量和大劑量復(fù)方紅豆杉膠囊處理組大鼠血清ALB含量降低，而AST、TBIL及ALT含量則均明顯增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組大鼠肝功能比較

注：與空白組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05

2 各組大鼠肝臟病理學(xué)比較 光鏡下顯示，正常組肝組織結(jié)構(gòu)正常，小葉邊界清晰，被膜無增厚，肝葉實質(zhì)細(xì)胞無壞死及變性，無淋巴細(xì)胞浸潤，肝板以小葉中央靜脈為中心放射排列，中央靜脈壁無增厚，未見結(jié)締組織增生，間質(zhì)細(xì)胞不增多且門管區(qū)三管清晰可見。模型組則出現(xiàn)肝癌細(xì)胞呈團(tuán)塊狀及梁索狀排列并向周圍組織浸潤，區(qū)域肝細(xì)胞大量非典型性增生，周圍組織肝細(xì)胞呈現(xiàn)點狀壞死及彌漫性水腫變形，結(jié)締組織明顯增生，肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞且匯管區(qū)出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤。小劑量、中劑量和大劑量復(fù)方紅豆杉膠囊處理組大鼠肝癌細(xì)胞排列紊亂，結(jié)締組織異常增生及胞核腫脹增大等現(xiàn)象較模型組均得到了明顯改善，尤其以高劑量組中最為顯著(圖1)。

A：空白組；B：模型組；C：小劑量組；D：中劑量組；E：高劑量組

3 各組大鼠肝臟HIF-1α、VEGF及PCNA表達(dá)比較 見表2。空白組肝臟中HIF-1α、VEGF及PCNA僅偶見陽性表達(dá)細(xì)胞，模型組肝臟中上述蛋白均呈強陽性表達(dá)，而小劑量、中劑量和大劑量復(fù)方紅豆杉膠囊處理組肝臟中HIF-1α、VEGF及PCNA陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)均顯著弱于模型組。Image-proplus 6.0軟件的半定量分析結(jié)果表明，與模型組比，空白組、小劑量、中劑量和大劑量復(fù)方紅豆杉膠囊處理組大鼠肝臟HIF-1α、VEGF及PCNA的相對表達(dá)量均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與空白組比，小劑量、中劑量和大劑量復(fù)方紅豆杉膠囊處理組上述蛋白相對表達(dá)量均明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖2～4)。

A：空白組；B：模型組；C：小劑量組；D：中劑量組；E：高劑量組

A：空白組；B：模型組；C：小劑量組；D：中劑量組；E：高劑量組

A：空白組；B：模型組；C：小劑量組；D：中劑量組；E：高劑量組

組 別nHIF-1αVEGFPCNA空白組81.00±0.00*1.00±0.00*1.00±0.00*模型組824.56±2.45#35.31±3.56#27.34±2.13#小劑量組818.31±1.87#19.23±1.98#21.33±2.08#中劑量組815.24±1.46*#16.24±1.68*#16.34±1.31*#大劑量組89.21±0.86*#8.45±0.92*#7.31±0.73*#

注：與對照組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05

討論

肝癌的轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)是造成患者死亡的最重要原因之一，以往臨床對于肝癌轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)的研究多集中于腫瘤組織與癌細(xì)胞自身，而目前對腫瘤組織與細(xì)胞的微環(huán)境研究則已發(fā)展成為抗腫瘤研究的新方向[7-8]。腫瘤微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移的重要場所，而HIF-1α、VEGF及PCNA等細(xì)胞因子在上述過程中均扮演著重要角色，上述蛋白可通過復(fù)雜的信息傳導(dǎo)通路為腫瘤組織提供適合發(fā)展的外部環(huán)境，不斷促進(jìn)腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移[9]。其中HIF-1α是人體中唯一的在腫瘤細(xì)胞特異性缺氧狀態(tài)時發(fā)揮活性的一種轉(zhuǎn)錄因子，可有效促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對缺氧微環(huán)境的適應(yīng)作用，參與腫瘤新生血管的生成，并促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、浸潤及轉(zhuǎn)移，在腫瘤的發(fā)展過程中起到關(guān)鍵作用[10-11]。VEGF則是機體中最重要且最直接的促血管生成因子之一，可直接促進(jìn)腫瘤新生血管的生成作用，其合成量與HIF-1α水平的變化情況成正比，具有顯著的相關(guān)性[12-13]。PCNA則能夠有效促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的大量增殖，并參與多種類型腫瘤組織的浸潤與轉(zhuǎn)移，其表達(dá)量可直接反映腫瘤細(xì)胞增殖及分化作用，在缺氧狀態(tài)下，該蛋白還可有效促進(jìn)HIF-1α的合成與分泌，間接的促進(jìn)腫瘤病灶血管生成作用[14-15]。由此可見，通過觀察HIF-1α、VEGF及PCNA等腫瘤微環(huán)境細(xì)胞因子的變化情況來監(jiān)測腫瘤病灶的動態(tài)，對于癌癥的治療具有重要意義。

復(fù)方紅豆杉膠囊是臨床常用于治療非小細(xì)胞癌的現(xiàn)代化中藥制劑，主要由紅豆杉、紅參與甘草等多種藥材所組成，具有活血祛瘀、消腫散結(jié)等功效，方中紅豆杉可消積、活血祛瘀、消腫散結(jié)及解毒；紅參則可扶正固本；甘草調(diào)和諸藥[16-17]?，F(xiàn)代藥學(xué)研究結(jié)果表明，復(fù)方紅豆杉膠囊中含有的紅豆杉總生物堿可有效阻滯機體HIF-1α的合成與釋放，從而抑制腫瘤的浸潤與侵襲；甘草次酸則可具有較強的保肝活性，可改善肝癌所導(dǎo)致的肝損傷；紅參水提取物則能夠抑制VEGF的合成，從而降低腫瘤新生血管的生成作用[18-20]。目前，臨床對于復(fù)方紅豆杉膠囊用于非小細(xì)胞癌的治療具有一定的研究基礎(chǔ)，而少數(shù)臨床觀察結(jié)果亦顯示該藥物治療肝癌亦具有較好的療效，但對于復(fù)方紅豆杉膠囊用于肝癌的治療機制與動物實驗研究則涉及較少。鑒于該藥物具有較好的抗肝癌及抗腫瘤微環(huán)境細(xì)胞因子的物質(zhì)基礎(chǔ)，筆者采用Walker-256移植性肝癌大鼠模型對復(fù)方紅豆杉膠囊抗肝癌活性及其對HIF-1α、VEGF及PCNA等腫瘤微環(huán)境細(xì)胞因子的表達(dá)的影響進(jìn)行了觀察，期望為該藥物的應(yīng)用及肝癌的治療藥物選擇提供一定的實驗依據(jù)。

綜上所述，復(fù)方紅豆杉膠囊可通過降低Walker-256移植性肝癌大鼠模型HIF-1α、VEGF及PCNA的表達(dá)，從而達(dá)到抑制腫瘤增長、降低癌細(xì)胞對肝細(xì)胞的損傷的目的，對復(fù)方紅豆杉膠囊用于肝癌的治療提供了較好參考價值。