黃登桂 周加義 秦穎超 王修啟

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院廣東省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室國(guó)家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東廣州510642)

畜牧生產(chǎn)中，斷奶仔豬腹瀉一直是導(dǎo)致其死亡率居高不下的重要原因之一。仔豬腹瀉問(wèn)題給畜牧業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失，農(nóng)業(yè)部數(shù)據(jù)顯示，2016年我國(guó)新生活仔豬8.79億頭，其中1.52億頭因腹瀉等疾病在斷奶前后死亡或淘汰。研究表明，甲氨蝶呤（metho?trexate，MTX）作為一種抗葉酸藥，可抑制DNA的合成，并干擾RNA的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的翻譯[1]。新陳代謝旺盛的腸上皮對(duì)外源刺激非常敏感，MTX損傷消化道黏膜的具體表現(xiàn)為：黏膜腺體排列不齊或崩壞，絨毛變短，部分?jǐn)嗔?、脫落，腸壁水腫[2]，進(jìn)而導(dǎo)致腸道營(yíng)養(yǎng)吸收能力下降，屏障功能被破壞，腸道微生物區(qū)系失衡，機(jī)體發(fā)生腹瀉[3-4]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)腸上皮更新至關(guān)重要，其活性過(guò)高或過(guò)低均會(huì)導(dǎo)致腸上皮穩(wěn)態(tài)失衡[5]。由于目前關(guān)于MTX誘發(fā)腸上皮更新障礙分子機(jī)制仍不清晰，因此有必要進(jìn)一步探索病理狀態(tài)下腸黏膜的穩(wěn)態(tài)情況，從而為畜牧生產(chǎn)過(guò)程中幼畜腹瀉的預(yù)防或治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

甲氨蝶呤：純度≥98%（大連美侖生物技術(shù)有限公司）。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞

昆明小鼠：購(gòu)至廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；CMT-93細(xì)胞：由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)庾慶華教授團(tuán)隊(duì)贈(zèng)予。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇體重相近的5～6周齡左右的昆明小鼠（公）64只，隨機(jī)分為兩組，兩組之間體重?zé)o顯著差異（P＞0.05），每組32個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1只小鼠。各組小鼠自由飲水、采食。兩組分別注射生理鹽水和50 mg/kg BW MTX溶液，連續(xù)注射2 d，第二次注射后72 h處死小鼠，進(jìn)行樣品采集。試驗(yàn)期間每日記錄料耗、飲水和體重，計(jì)算小鼠的日平均采食量、日飲水量和日增重。

將接種的CMT-93細(xì)胞置于37℃、飽和濕度、95%空氣+5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，分別加入0、0.025、0.05、0.10 μM和0.20 μM MTX進(jìn)行處理。

1.4 樣品收集

采用頸椎脫臼法處死小鼠后，剖開(kāi)腹腔，分離十二指腸、空腸和回腸，測(cè)量各腸段長(zhǎng)度，去除內(nèi)容物，洗凈后稱量重量，單位長(zhǎng)度腸重（mg/cm）=腸道重量/腸道長(zhǎng)度。分別采集各腸段樣品兩份，一份保存于4%多聚甲醛中，另一份保存于-80℃冰箱中備用。

去除培養(yǎng)板里的細(xì)胞培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS清洗2次，加入200μl RIPA裂解液，12 000 r/min離心10 min，取上清，用BCA法測(cè)定樣品蛋白質(zhì)濃度，消煮后置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 腸道形態(tài)學(xué)觀察

將小鼠腸道經(jīng)乙醇逐級(jí)脫水、二甲苯透明、透蠟、包埋、切片（5μm）和H&E染色后，光鏡下觀察小鼠腸道黏膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)，每只小鼠取2張H&E染色切片，每張切片選5個(gè)視野拍照，用Image-Pro Plus 6.0軟件測(cè)量每張照片中5根最長(zhǎng)絨毛處的絨毛高度及隱窩深度。腸絨毛高度指從腸腺絨毛聯(lián)結(jié)處到絨毛頂端的高度，隱窩深度指從腸腺基部到腸腺絨毛聯(lián)結(jié)處的高度。

1.6 MTT法

取處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的細(xì)胞以2×103個(gè)/孔接種于96孔板中，分別用不同濃度的MTX處理，并于處理后0、24、48 h和72 h，隨機(jī)取一塊96孔板，每孔加入20μl MTT工作液，置培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h；吸干孔中的培養(yǎng)液，每孔加入150μl DMSO，在搖床上100 r/min搖晃30 min，使其充分混勻；選擇490 nm波長(zhǎng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔光吸收值，即A490處的OD值，最后以時(shí)間為橫軸，OD值為縱軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.7 CMT-93跨膜電阻測(cè)定

分別往transwell上室和下室中加入100μl和600μl的完全培養(yǎng)基，用電阻儀測(cè)定其電阻值，記錄為該transwell的本底電阻值。吸除上室的培養(yǎng)基，加入100 μl濃度為1×107cells/ml的CMT-93細(xì)胞，隔天更換上室和下室的培養(yǎng)基，每天測(cè)定其跨膜電阻，至跨膜電阻值穩(wěn)定，加入MTX孵育24 h測(cè)定跨膜電阻值。細(xì)胞跨膜電阻值=（測(cè)定值-本底值）×培養(yǎng)面積，細(xì)胞跨膜電阻比率（%，baseline）=處理組細(xì)胞跨膜電阻值/對(duì)照組細(xì)胞跨膜電阻值×100。

1.8 蛋白質(zhì)免疫印跡

組織和細(xì)胞蛋白質(zhì)樣品經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、顯色、一抗孵育、二抗孵育后，在FluorChem M apparatus凝膠成像儀中捕捉膜上條帶信息，并用Image J2x軟件統(tǒng)計(jì)條帶灰度值。蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量=總蛋白質(zhì)/β-actin。

1.9 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，數(shù)據(jù)處理與分析采用SAS 9.2的GLM程序進(jìn)行，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 小鼠生長(zhǎng)性能（見(jiàn)表1）

表1 MTX對(duì)小鼠生長(zhǎng)性能的影響

表1可見(jiàn)，與對(duì)照組比較，腹腔注射50 mg/kg BW MTX顯著降低小鼠平均日采食量、平均日飲水量和平均日增重（P＜0.05），其中平均日采食量降低了33.81%，平均日飲水量降低了32.88%，平均日增重降低74.45%。

2.2 小鼠單位長(zhǎng)度腸重(見(jiàn)表2)

表2 MTX對(duì)小鼠單位長(zhǎng)度腸重的影響(mg/cm)

由表2可知，MTX顯著降低了小鼠的十二指腸、空腸和回腸單位長(zhǎng)度腸重（P＜0.05），其中十二指腸降低了14.45%，空腸降低了28.14%，回腸降低了15.17%。

2.3 小鼠空腸形態(tài)學(xué)

由圖1可見(jiàn)，MTX可導(dǎo)致空腸絨毛嚴(yán)重萎縮，絨毛變短，固有層裸露，黏膜隱窩明顯增生。

圖1 MTX對(duì)空腸形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

表3可知，與對(duì)照組相比，MTX組小鼠空腸絨毛高度顯著降低，隱窩深度顯著增加，絨毛高度與隱窩深度的比值顯著降低（P＜0.05）。

表3 MTX對(duì)小鼠腸道黏膜指數(shù)的影響

2.4 CMT-93細(xì)胞增殖活力

不同濃度MTX對(duì)CMT-93細(xì)胞增殖活力的影響見(jiàn)圖2。由圖可知，0.025、0.05、0.10、0.20 μM MTX處理24 h即可顯著降低細(xì)胞增殖活力（P＜0.05），且這種抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性。

2.5 CMT-93細(xì)胞跨膜電阻值測(cè)定

CMT-93細(xì)胞跨膜電阻值（TEER）測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖3。0.025、0.05μM MTX處理24 h顯著降低了CMT-93細(xì)胞跨膜電阻值（P＜0.05）。

2.6 緊密連接蛋白表達(dá)

由圖4可知，與對(duì)照組相比，MTX組小鼠空腸和CMT-93細(xì)胞中緊密連接蛋白ZO-1和Occludin的表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。

2.7 β-catenin、PCNA和Caspase-3蛋白質(zhì)表達(dá)

由圖5可知，MTX顯著降低了小鼠空腸和CMT-93細(xì)胞中β-catenin和PCNA蛋白質(zhì)表達(dá)（P＜0.05），增加了Caspase-3的表達(dá)（P＜0.05）。

3 討論

3.1 MTX對(duì)小鼠生長(zhǎng)性能的影響

研究表明，MTX可誘導(dǎo)系列活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）的產(chǎn)生，促進(jìn)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)到小腸組織，減少腸上皮細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽（Glutathione,GSH）的含量，升高腸道黏膜中丙二醛（Malondialde?hyde,MDA）的含量，從而導(dǎo)致腸黏膜炎癥[6]，而急性腸黏膜炎可引起小鼠采食量急劇下降或不食，體重降低。此外，MTX還會(huì)降低小腸上的乳糖酶和麥芽糖酶活性，導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)無(wú)法被充分消化吸收，進(jìn)而降低動(dòng)物的生長(zhǎng)性能[7-8]。與此相似，本研究發(fā)現(xiàn)，小鼠腹腔注射MTX會(huì)導(dǎo)致其采食量、飲水量和日增重降低。

圖2 MTX對(duì)CMT-93細(xì)胞增殖活力的影響

3.2 MTX對(duì)腸道黏膜指數(shù)的影響

腸道是消化和吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的重要場(chǎng)所，也是維持體內(nèi)平衡的重要屏障。腸道完整性被破壞后，不僅會(huì)引起營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化和吸收障礙，使大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在后腸堆積，引發(fā)異常發(fā)酵，誘導(dǎo)動(dòng)物腹瀉，而且會(huì)導(dǎo)致有害菌的遷移和移位[8-9]。大量研究結(jié)果表明，MTX能造成腸黏膜缺失，絨毛萎縮、脫落，隱窩形態(tài)喪失，黏膜腺體排列不均勻，杯狀細(xì)胞減少甚至消失，腸微絨毛變細(xì)、稀疏，高爾基復(fù)合體水腫擴(kuò)張，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫大[10-13]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，給小鼠注射MTX會(huì)導(dǎo)致其十二指腸、空腸和回腸單位長(zhǎng)度重量顯著降低，腸道黏膜形態(tài)被破壞，絨毛高度降低，隱窩增生明顯，上皮細(xì)胞脫落、壞死。

圖3 MTX對(duì)CMT-93細(xì)胞跨膜電阻的影響

圖4 MTX對(duì)小鼠空腸和CMT-93細(xì)胞中緊密連接蛋白ZO-1、Occludin表達(dá)的影響

3.3 MTX對(duì)腸道屏障功能的影響

腸道上皮屏障的完整結(jié)構(gòu)是由腸道上皮細(xì)胞與相鄰細(xì)胞之間的緊密連接組成的，緊密連接對(duì)黏膜屏障功能和腸滲透性起到關(guān)鍵作用[14]。其中閉合小環(huán)蛋白ZO是緊密連接支持結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，跨膜蛋白Oc?cludin是緊密連接的結(jié)構(gòu)骨架。研究表明Occludin敲除鼠雖然腸上皮形態(tài)結(jié)構(gòu)表現(xiàn)正常，但是連接的完整性降低[15]。Hamada K等[16]和何秋穎等[9]發(fā)現(xiàn)，MTX顯著減少了大鼠空腸上皮ZO-1的分布，降低了腸黏膜組織中Occludin mRNA及蛋白表達(dá)水平。而腸上皮跨膜電阻值降低和通透性增加與ZO-1和Occludin的表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)分布的改變有關(guān)，MTX可顯著增加大鼠腸道對(duì)FD4的透過(guò)率[16]和血漿中D-乳酸的含量[17]，說(shuō)明腸黏膜通透性發(fā)生了改變，與本研究中MTX降低CMT-93細(xì)胞TEER值一致。

3.4 MTX對(duì)小鼠腸上皮更新的影響及其機(jī)理

Wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞的增殖過(guò)程影響腸上皮的發(fā)育[18-19]，同時(shí)還能通過(guò)抑制c-Myc誘導(dǎo)Caspase的釋放，從而達(dá)到抑制凋亡的作用[20]。βcatenin是Wnt信號(hào)通路下游最主要的信號(hào)因子，βcatenin可調(diào)控其下游靶基因Cyclin D1，促進(jìn)細(xì)胞增殖[21]。而細(xì)胞增殖和凋亡之間的穩(wěn)態(tài)平衡對(duì)于小腸的生理和結(jié)構(gòu)屏障功能的維持是必需的，這種平衡遭到破壞時(shí)將會(huì)引起腸上皮萎縮。本研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是小鼠空腸組織還是CMT-93細(xì)胞，MTX均可降低βcatenin和增殖細(xì)胞標(biāo)志PCNA蛋白質(zhì)表達(dá)，增加細(xì)胞凋亡執(zhí)行者Caspase-3表達(dá)，表明MTX降低Wnt/βcatenin信號(hào)通路活性，抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，破壞腸上皮更新進(jìn)程。

4 結(jié)論

圖5 MTX對(duì)小鼠空腸和CMT-93細(xì)胞中β-catenin、PCNA和Caspase-3蛋白質(zhì)表達(dá)的影響

①腹腔注射甲氨蝶呤可顯著降低小鼠生長(zhǎng)性能，損傷腸道黏膜結(jié)構(gòu)。

② MTX降低Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性，抑制腸上皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，破壞腸道屏障功能。