于敬坤，韓學(xué)超，李明志，隨振陽，張 琪，王長友

1.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院普外科(唐山 063000);2 華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗研究中心 (唐山 063000)

我國是腫瘤大國，惡性腫瘤發(fā)生率、病死率均高于世界平均水平，有研究指出我國腫瘤發(fā)病率正以每年3%～5% 的速度增加，病死率也由20 世紀(jì)70 年代以來一直呈上升趨勢[1-4]。食管癌是我國常見十大惡性腫瘤之一，具有高發(fā)病率、高病死率等特點(diǎn)。Kobayashi等[5]的體外研究表明，二甲雙胍可通過下調(diào)食管癌細(xì)胞周期的相關(guān)蛋白，抑制其生長、增殖。本實驗通過檢測Eca-109食管癌細(xì)胞在鹽酸二甲雙胍的作用下，其增殖能力、遷移能力的變化，觀察遷移相關(guān)蛋白的改變，探索二甲雙胍影響Eca-109食管癌細(xì)胞遷移能力的機(jī)制。

材料與方法

1 材 料 惡性腫瘤細(xì)胞株：Eca-109食管癌細(xì)胞獲贈于華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗研究中心。主要試劑及儀器：DMEM完全培養(yǎng)基[賽默飛世爾(蘇州)儀器有限公司]；胎牛血清(浙江天杭生物公司)；青鏈霉素混合液、胰蛋白酶(美國Gibco分司)；鹽酸二甲雙胍(北京索萊寶科技有限公司)；MTT試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)研究所)；96孔板、6孔板(德國Eppendorfna分司)；酶標(biāo)儀、顯影儀、電泳轉(zhuǎn)膜相關(guān)器材(上海Bio-Rad公司)；MMP-14、GLUT1抗體(臺灣Arigo公司)；MMP-2、MMP-9抗體(美國Cell Signaling公司)；β-Actin抗體[天徳悅(北京)生物科技有限責(zé)任公司]；HRP標(biāo)記山羊抗小鼠/兔IgG(H+L)(上海碧云天生物技術(shù)研究所)等。

2 方 法 ①細(xì)胞培養(yǎng)：Eca-109食管癌細(xì)胞是用細(xì)胞培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液的DMEM完全培養(yǎng)基)培養(yǎng)，并置于37℃恒溫、95%O2、5%CO2空氣孵箱中(相對濕度95%)。依據(jù)細(xì)胞密度按1∶2或1∶3比例傳代(傳代時間約為2～3 d)，Eca-109食管癌細(xì)胞呈貼壁生長，待形成致密單層細(xì)胞，利用胰蛋白酶消化并形成均勻單一的游離細(xì)胞后，取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。② MTT實驗檢測細(xì)胞增殖情況：將Eca-109食管癌細(xì)胞均勻地播種于96孔板中(每個培養(yǎng)孔內(nèi)約有104個細(xì)胞)，待細(xì)胞完全貼壁后，給予含有不同濃度鹽酸二甲雙胍(0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/ml)的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)。24 h后，移除培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)或生理鹽水沖洗細(xì)胞兩次(避免藥物與MTT試劑反應(yīng)而未形成結(jié)晶或未完全形成結(jié)晶)。在每孔中加入了100 μl的不含藥物的單純細(xì)胞培養(yǎng)液及10 μl濃度為5 mg /ml的MTT試劑(MTT溶于PBS液或生理鹽水中)。將96孔板置于恒溫箱中孵化4 h以上，待紫藍(lán)色結(jié)晶完全形成，小心移除DMEM完全培養(yǎng)基(盡量避免吸走結(jié)晶)，然后每個孔內(nèi)都注入100 μl的二甲基亞砜溶液(DMSO)，并置于搖床上中速搖勻10 min。結(jié)晶完全溶解后，使用酶標(biāo)儀測各孔在490 nm波長處的吸光值(OD值，OD值可反映各孔相對細(xì)胞數(shù)量，間接反映細(xì)胞增殖能力)。重復(fù)實驗3次，SPSS Statistic 17.0軟件評估所測數(shù)據(jù)。根據(jù)藥物劑量依賴性實驗,1.50 mg/ml鹽酸二甲雙胍對Eca-109食管癌細(xì)胞在作用24、48、72 h時均具有抑制作用，且在有效抑制范圍內(nèi)，未達(dá)抑制峰值，作為實驗藥物濃度，便于調(diào)控(鹽酸二甲雙胍分子量約為165,1.50 mg/ml鹽酸二甲雙胍≈10 μmol/ml鹽酸二甲雙胍，二甲雙胍主要在小腸內(nèi)被人體吸收，口服二甲雙胍后2 h即可達(dá)藥物濃度峰值2 μg/ml，藥物易積聚于腸壁，為血漿濃度的10～100倍，體外實驗藥物濃度需控制在體內(nèi)用藥的20倍以內(nèi)，考慮含服鹽酸二甲雙胍可使食管癌細(xì)胞周圍藥物濃度增加)，因此可采用1.50 mg/ml鹽酸二甲雙胍作為后續(xù)實驗的藥物濃度)。另取一潔凈的96孔板，檢測1.50 mg/ml鹽酸二甲雙胍作用于Eca-109食管癌細(xì)胞24、48、72 h時的細(xì)胞增殖能力(MTT操作步驟同上)。③劃痕實驗觀察細(xì)胞遷移能力：預(yù)先用潔凈的記號筆在6孔板背面劃橫線，盡可能均勻、平直，約隔0.5～1.0 cm一道，橫穿每孔底部，每孔至少有3條線穿過。將Eca-109食管癌細(xì)胞均勻地播種在預(yù)處理的6孔板中培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)70%～80%時，用200 μl無菌槍頭盡量垂直于6孔板底部的橫線做劃痕，PBS液或生理鹽水洗去劃下的細(xì)胞，在倒置顯微鏡下取筆直一段做觀察并攝影，給予含有1.50 mg/ml鹽酸二甲雙胍的細(xì)胞培養(yǎng)液(設(shè)置為MET組)及單純細(xì)胞培養(yǎng)液(設(shè)置為CK組)于37℃恒溫、95%O2、5%CO2空氣孵箱中培養(yǎng)，作用24、48 h時觀察細(xì)胞于劃痕處的細(xì)胞遷移、生長情況，用Image J及SPSS Statistic 17.0處理圖像、數(shù)據(jù)，分析兩組無細(xì)胞區(qū)域的面積占比及其平均值并判斷其差異是否有統(tǒng)計學(xué)差異。用細(xì)胞遷移指數(shù)(Migration index，MI)表示細(xì)胞遷移的快慢。MI=100%(S0-St)/S0,St是指劃痕后t h后測得的無細(xì)胞區(qū)域面積占比，S0是指劃痕后即可測得的無細(xì)胞區(qū)域面積占比,St-S0是指t h到劃痕初這段時間內(nèi)無細(xì)胞區(qū)域占比變化值。④Western blotting觀察鹽酸二甲雙胍對Eca-109食管癌細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白MMP-2、MMP-9、MMP-14、Glut1表達(dá)活性的影響：用含1.50 mg/ml的鹽酸二甲雙胍與單純細(xì)胞培養(yǎng)液分別培養(yǎng)Eca-109食管癌細(xì)胞，48 h后用組織、細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞并提取細(xì)胞蛋白，BCA法測定蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液后于100℃下變性5 min。依次制備8%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜將蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜(PVDF膜)上，常溫下用封閉液(5%脫脂奶粉、0.02 mmol/L Tris-HCL、0.5 mmol/L NaCl、0.1%吐溫20、pH 7.5)封閉2 h以上，TBST(0.02 mmol/L Tris-HCL、0.5 mmol/L NaCl、0.1%吐溫20、pH 7.5)洗膜3次后，加入一抗并在4℃冰箱內(nèi)過夜，次日TBST洗膜3次后加入二抗常溫孵化2 h以上，TBST洗凈二抗，加入顯影劑在顯影儀內(nèi)顯影，以β-Actin為內(nèi)參蛋白，在內(nèi)參平齊的前提下，觀察并用Image J及SPSS Statistic 17.0處理蛋白條影、分析數(shù)據(jù)，評估MET、CK兩組細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。

結(jié) 果

1 鹽酸二甲雙胍對體外Eca-109食管癌細(xì)胞增殖能力的影響 含不同濃度鹽酸二甲雙胍的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)Eca-109食管癌細(xì)胞48 h后，隨著藥物濃度的增高，96孔板各孔的OD值逐漸降低(圖1)。

圖1 不同濃度鹽酸二甲雙胍作用于體外

用含1.50 mg/ml鹽酸二甲雙胍的細(xì)胞培養(yǎng)液(MET組)與不含鹽酸二甲雙胍的細(xì)胞培養(yǎng)液(CK組)培養(yǎng)Eca-109食管癌細(xì)胞24、48、72 h，MET組的OD值均小于CK組(圖2)，見表1；相對增殖能力也隨鹽酸二甲雙胍作用時間的延長而遞減(細(xì)胞相對增殖能力=100%×某時刻實驗組細(xì)胞增殖能力/同時刻對照組細(xì)胞增殖能力)(圖2)。

2 1.50 mg/ml鹽酸二甲雙胍對體外Eca-109食管癌細(xì)胞遷移能力的影響 劃痕后24 h，MET組無細(xì)胞區(qū)域面積占比明顯高于CK組；而劃痕后0、48 h，MET組及CK組無細(xì)胞區(qū)域面積占比無統(tǒng)計學(xué)差異(圖3)，見表2；細(xì)胞遷移指數(shù)(MI)也表現(xiàn)為劃痕后24 h，MET組小于CK組，48 h時兩組無統(tǒng)計學(xué)差異，細(xì)胞遷移指數(shù)(MI)均為1，表現(xiàn)為48 h時兩組細(xì)胞劃痕處均已愈合(圖3)，見表3。

3 1.50 mg/ml鹽酸二甲雙胍對體外Eca-109食管癌細(xì)胞遷移能力相關(guān)蛋白MMP-2、MMP-9及GLUT1、MMP-14的影響 含1.5 mg/ml鹽酸二甲雙胍的細(xì)胞培養(yǎng)液體外培養(yǎng)Eca-109食管癌細(xì)胞48 h后，MET組遷移相關(guān)蛋白MMP-2、MMP-9的表達(dá)量分別是(0.4026±0.2224)、(0.5009±0.2728),均明顯少于CK組的(1.0309±0.0687)、(1.0167±0.0905),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖4)；蛋白GLUT1、MMP-14的表達(dá)量也表現(xiàn)為CK組的(1.1991±0.2134)、(1.0025±0.1179)高于MET組的(0.7751±0.3114)、(0.6495±0.2563),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖5)。

表1 1.50 mg/ml鹽酸二甲雙胍對體外Eca-109食管癌細(xì)胞增殖能力的影響

圖2 1.50 mg/ml鹽酸二甲雙胍對Eca-109食管癌細(xì)胞增殖能力及相對增殖能力的影響

圖3 1.50 mg/ml鹽酸二甲雙胍對體外Eca-109食管癌細(xì)胞遷移能力的影響(40×)

表2 劃痕后0、24、48 h的無細(xì)胞區(qū)域面積占比(%Area)

表3 劃痕后24、48 h的細(xì)胞遷移指數(shù)(MI)

討 論

我國是食管癌高發(fā)地區(qū)，其發(fā)病率及死亡率均居世界首位，有研究指出，我國2011年新增食管癌患者近30萬例，死亡人數(shù)約22萬例，占據(jù)世界一半以上，我國食管癌發(fā)病率及病死率約占世界的64.7%及54.7%，2012年較2011年比例有所下降，其發(fā)病率、病死率約為50%、49%，但我國人口基數(shù)大,每年仍有很多患者承受食管癌病痛的折磨[6]。

注：MET組Eca-109食管癌細(xì)胞的MMP-2、MMP-9的表達(dá)量與CK組比較，#P<0.05

注：MET組Eca-109食管癌細(xì)胞的GLUT1、MMP-14的表達(dá)量與CK組比較，#P<0.05

二甲雙胍(Metformin,MET)是重要的臨床降血糖藥物，具有良好的短期、長期降糖效果[7-10]。有研究表明，二甲雙胍可使中國新診斷的2型糖尿病患者的 HbA1c水平降低1.8%(可能含安慰劑效應(yīng)),并且不受體重的影響[11]。英國的一項病例對照研究資料表明，二甲雙胍的使用與惡性腫瘤發(fā)生風(fēng)險的下降具有一定相關(guān)性，二甲雙胍使用時間的延長及使用次數(shù)的增加，可使惡性腫瘤的發(fā)病風(fēng)險降低[12-13]，這可能通過促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)脂類物質(zhì)代謝、調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)分泌水平、抑制血小板亢進(jìn)及降低血液高凝狀態(tài)等途徑，抑制腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展[14]。通過該實驗可明顯發(fā)現(xiàn)，隨著鹽酸二甲雙胍藥物濃度的增高，Eca-109食管癌細(xì)胞的增殖能力表現(xiàn)為遞減趨勢；當(dāng)給予含1.50 mg/ml鹽酸二甲雙胍的細(xì)胞培養(yǎng)基體外培養(yǎng)Eca-109食管癌細(xì)胞24、48、72 h時，其增殖能力均弱于對照組，并具有統(tǒng)計學(xué)差異；相對增殖能力也隨時間的遞增而遞減，表明MET組Eca-109食管癌細(xì)胞增殖能力受抑制程度具有時間相關(guān)性。MTT實驗結(jié)果說明鹽酸二甲雙胍可抑制Eca-109食管癌細(xì)胞的生長、增殖，降低Eca-109食管癌細(xì)胞的增殖能力，并表現(xiàn)為劑量及時間依賴性。

惡性腫瘤細(xì)胞具有高增殖能力、高遷移能力、分化程度低等特點(diǎn)，也是區(qū)別于正常細(xì)胞的重要特性。食管癌患者早期一般無特殊癥狀，當(dāng)出現(xiàn)進(jìn)行性吞咽困難、飲水嗆咳、痰中帶血或咯血等臨床癥狀時，很大比例的患者已發(fā)生腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，可侵犯臨近組織及器官，當(dāng)食管癌侵犯氣管時會引起患者長期刺激性咳嗽，侵犯聲帶時引起患者聲嘶等。有臨床研究表明，在糖尿病人群中，長期服用二甲雙胍的患者，其惡性腫瘤發(fā)生率及轉(zhuǎn)移率要低于非二甲雙胍治療人群，注射胰島素治療的患者，其腫瘤發(fā)生風(fēng)險、轉(zhuǎn)移率要高于非胰島素治療人群[15-16]。劃痕實驗是檢驗細(xì)胞遷移能力的重要實驗之一，在實驗中，MET組與CK組對比，劃痕后24 h，MET組無細(xì)胞區(qū)域面積占比明顯高于CK組，細(xì)胞遷移指數(shù)(MI)明顯低于CK組，表明鹽酸二甲雙胍可抑制Eca-109食管癌細(xì)胞的遷移能力；遷移后48 h，兩組的無細(xì)胞區(qū)域面積占比及細(xì)胞遷移指數(shù)(MI)均統(tǒng)計學(xué)差異，但CK組于劃痕后24 h的無細(xì)胞區(qū)域面積占比低于MET組，不除外劃痕24 h后CK組的遷移速度高于MET組；結(jié)合鏡下觀察及統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果，鹽酸二甲雙胍可抑制Eca-109食管癌細(xì)胞的遷移能力。

基質(zhì)金屬蛋白酶系(MMPs)是鋅依賴性蛋白水解酶家族[17]，在正常組織細(xì)胞中，MMPs表達(dá)量極少。MMPs可以降解細(xì)胞外基質(zhì)，引發(fā)細(xì)胞從組織中脫落，在腫瘤細(xì)胞中，MMPs的高表達(dá)，易使腫瘤細(xì)胞脫落，從而發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移；MMPs中的明膠酶 MMP-2、MMP-9在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)量一般遠(yuǎn)高于正常細(xì)胞，這與腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系[18-20]。由Western blotting結(jié)果可見，經(jīng)鹽酸二甲雙胍處理后的Eca-109食管癌細(xì)胞的MMP-2、MMP-9的表達(dá)量均少于CK組，聯(lián)系劃痕實驗結(jié)果，提示鹽酸二甲雙胍可能通過降低MMP-2,、MMP-9的表達(dá)量抑制Eca-109食管癌細(xì)胞的遷移能力。MMP-14(膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1，MT1-MMP)同樣具有消化細(xì)胞外基質(zhì)作用，與此之外，MMP-14還參與多種細(xì)胞組織的病理生理過程，是最典型的膜型基質(zhì)金屬蛋白酶(MT1-MMP)[21],MMP-14主要存在于細(xì)胞膜上，可以激活部分明膠酶(如MMP-2、MMP-9)。人源葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(GLUT1)主要促進(jìn)葡萄糖以擴(kuò)散形式進(jìn)入紅細(xì)胞，也有轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖入腦及其他組織供能等作用，有研究指出GLUT1會在惡性腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)狀態(tài)，可能是誘發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移的中介物質(zhì)，GLUT1與MMP-14關(guān)系密切，可激活MMP-14使其發(fā)揮生理功能[22]。鹽酸二甲雙胍處理后的Eca-109食管癌細(xì)胞的GLUT1、MMP-14表達(dá)量相對于CK組明顯下降，提示鹽酸二甲雙胍降低Eca-109食管癌細(xì)胞遷移能力可能與抑制Eca-109食管癌細(xì)胞內(nèi)的GLUT1、MMP-14表達(dá)量有關(guān)。

綜上所述，鹽酸二甲雙胍可抑制體外Eca-109食管癌細(xì)胞的生長、增殖；并且可能通過抑制GLUT-1、MMP-14、MMP-2、MMP-9信號通路抑制體外Eca-109食管癌細(xì)胞的遷移能力。