寧鈞宇 敬海明 杜宏舉 齊麗娟 高 珊 李國(guó)君,3

(1.北京市疾病預(yù)防控制中心 北京市預(yù)防醫(yī)學(xué)研究中心衛(wèi)生毒理所，北京 100013； 2.北京市食物中毒診斷溯源技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100013； 3.首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，北京 100069)

胰島素樣生長(zhǎng)因子1(insulin like growth factor 1，IGF-1)是一種小分子多肽類生長(zhǎng)因子，能夠特異性結(jié)合細(xì)胞膜表面IGF-1受體，誘發(fā)酪氨酸位點(diǎn)磷酸化從而導(dǎo)致受體激活，并進(jìn)一步活化下游信號(hào)如磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3 kinase，PI3K)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)等通路，刺激多種正常和腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增生[1]。IGF-1信號(hào)通路的活性，在涉及血管平滑肌細(xì)胞增生的動(dòng)脈粥樣硬化及惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是維護(hù)細(xì)胞內(nèi)能量代謝平衡的關(guān)鍵 “傳感器”及“效應(yīng)器”：AMPK對(duì)細(xì)胞內(nèi)AMP/ATP比例變化高度敏感，AMP/ATP比例升高導(dǎo)致AMPK活化，表現(xiàn)為α亞單位172位蘇氨酸殘基的磷酸化?；罨腁MPK具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性，通過(guò)磷酸化特異性蛋白底物，將信號(hào)向下游傳遞，抑制合成代謝等耗能過(guò)程，促進(jìn)分解代謝等產(chǎn)能過(guò)程[2-3]，從而使細(xì)胞內(nèi)維持必要的ATP濃度滿足生理需要。另外，AMPK參與包括IGF-1在內(nèi)多種生長(zhǎng)因子信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，通過(guò)直接磷酸化結(jié)節(jié)性硬化蛋白2(tuberous sclerosis 2，TSC2)從而抑制生長(zhǎng)因子激活的雷帕霉素靶蛋白1 (mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1)信號(hào)通路[4]。因此，AMPK被認(rèn)為是溝通能量代謝和生長(zhǎng)信號(hào)的關(guān)鍵性分子，能夠?qū)ιL(zhǎng)因子受體活化信號(hào)與細(xì)胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)起協(xié)調(diào)作用。

筆者曾經(jīng)報(bào)道AMPK通過(guò)磷酸化胰島素受體底物-1(insulin receptor substrate-1, IRS-1) 794位絲氨酸和TSC2 1 345位絲氨酸抑制IGF-1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而抑制IGF-1刺激引起的血管平滑肌細(xì)胞增生及蛋白質(zhì)合成，抑制AMPK活性導(dǎo)致IGF-1信號(hào)通路活化增強(qiáng)[5]。這里，筆者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，AMPK還能夠通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi)重要的增生信號(hào)分子細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinases 1/2，ERK1/2)的活化來(lái)抑制血管平滑肌細(xì)胞IGF-1信號(hào)通路。

1 材料與方法

1.1 試劑和抗體

二甲雙胍購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；細(xì)胞培養(yǎng)試劑、轉(zhuǎn)染試劑和抗生素購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；IGF-1購(gòu)自天漠公司；抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling 公司；化學(xué)發(fā)光試劑購(gòu)自美國(guó)Thermal公司。

1.2 慢病毒載體構(gòu)建

Lac Z病毒表達(dá)載體和兩種帶有HA標(biāo)簽蛋白的組成性激活型AMPK構(gòu)建引物序列及病毒表達(dá)載體構(gòu)建方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[5]，所構(gòu)建的兩種組成性激活型AMPK分別為AMPK α亞單位氨基端312個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的截?cái)囿w以及將該截?cái)囿w第172位蘇氨酸殘基置換為門冬氨酸殘基。敲低AMPK寡核苷酸序列及病毒載體構(gòu)建方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[5]。

1.3 慢病毒包裝及細(xì)胞感染

用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法包裝慢病毒，詳見(jiàn)參考文獻(xiàn)[5]。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

血管平滑肌細(xì)胞原代分離培養(yǎng)自豬主動(dòng)脈，方法參見(jiàn)Gockerman等[6]報(bào)道。細(xì)胞培養(yǎng)于葡萄糖濃度為5 mmol/L，含10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。傳5至16代的原代培養(yǎng)細(xì)胞血清饑餓20 h后，加入3 mmol/L二甲雙胍處理20 h，再加入20 ng/mL IGF-1作用10 min，棄培養(yǎng)基，收集細(xì)胞，提取蛋白，行免疫印跡檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。慢病毒感染細(xì)胞并獲得穩(wěn)定感染細(xì)胞系方法詳見(jiàn)參考文獻(xiàn)[5]，慢病毒感染細(xì)胞血清饑餓20 h后，加入20 ng/mL IGF-1作用10 min，收集細(xì)胞，免疫印跡檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。

1.5 細(xì)胞增生實(shí)驗(yàn)

各種細(xì)胞分別接種于六孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)基為含5 mmol/L葡萄糖、0.2%(體積分?jǐn)?shù))貧血小板血漿(platelet-poor plasma)的無(wú)血清DMEM。50 ng/mL IGF-1作用48 h后，細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算各種細(xì)胞IGF-1刺激組與未加IGF-1組細(xì)胞數(shù)的比值，重復(fù)3次，計(jì)算均值并比較[7]。

1.6 蛋白質(zhì)免疫印跡

收集不同處理細(xì)胞的總蛋白質(zhì)，變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)膜，一抗孵育，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗孵育，化學(xué)發(fā)光法成像。詳見(jiàn)參考文獻(xiàn)[5]。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 AMPK抑制IGF-1刺激引起的ERK1/2活化

為了觀察AMPK在IGF-1信號(hào)通路中的作用，采用AMPK激活劑二甲雙胍處理血清饑餓的血管平滑肌細(xì)胞，并檢測(cè)IGF-1刺激引起的ERK1/2活化狀態(tài)。IGF-1的作用能明顯降低血管平滑肌細(xì)胞AMPK 第172位蘇氨酸的磷酸化，提示IGF-1的作用導(dǎo)致AMPK的活化受到抑制；同時(shí)，ERK1/2的磷酸化明顯增高，表明IGF-1的作用導(dǎo)致ERK1/2信號(hào)活化。二甲雙胍預(yù)處理16～18 h明顯提高細(xì)胞內(nèi)AMPK活性，在二甲雙胍預(yù)處理?xiàng)l件下，IGF-1作用不能明顯抑制AMPK活化。同時(shí)，與IGF-1單獨(dú)作用相比，IGF-1與二甲雙胍聯(lián)合作用下，細(xì)胞內(nèi)ERK1/2活性明顯降低，提示AMPK活性能夠抑制IGF-1刺激引起的血管平滑肌細(xì)胞ERK1/2活化，詳見(jiàn)圖1。

圖1 AMPK抑制IGF-1刺激引起的ERK1/2活化Fig.1 Effect of AMPK inhibition on IGF-1-stimulated activation of ERK1/2

Porcinevascular smooth muscle cells(pSMC) were incubated in serum-free medium for 40 h. Metformin (Met) was added for the last 20 h at the concentration of 3 mmol/L followed by IGF-1 (20 ng/mL) for 10 min. The cell lysates were immunoblotted with anti-p-AMPK (T172), anti-AMPK, anti-p-ERK1/2(T202/Y204) and anti-ERK1/2 antibodies, respectively.p-AMPK：phospho-AMP-activated protein kinase；AMPK：AMP-activated protein kinase；p-ERK1/2：phospho-extracellular signal-regulated kinases 1/2；ERK1/2：extracellular signal-regulated kinases 1/2；IGF-1：insulin like growth factor-1.

2.2 組成性激活型AMPK抑制IGF-1刺激引起的ERK1/2活化及細(xì)胞增生

為了證實(shí)AMPK能夠抑制IGF-1刺激引起的ERK1/2活化，構(gòu)建了兩種表達(dá)組成性激活型AMPK的慢病毒載體，AMPK(1～312)和AMPK(1～312)T172D,后者將前者第172位蘇氨酸定點(diǎn)突變?yōu)樘扉T冬氨酸(圖2A)，并分別感染血管平滑肌細(xì)胞(圖2B)，與作為對(duì)照的表達(dá)LacZ慢病毒感染細(xì)胞相比，兩種組成性激活型AMPK過(guò)表達(dá)細(xì)胞中，IGF-1刺激引起的ERK1/2活化均受到明顯抑制(圖2C)。由于ERK1/2活化是促進(jìn)細(xì)胞增生的重要信號(hào)，并在IGF-1刺激引起的細(xì)胞增生中發(fā)揮關(guān)鍵作用，檢測(cè)了AMPK對(duì)IGF-1刺激引起的細(xì)胞增生的影響，結(jié)果顯示，與表達(dá)LacZ慢病毒感染細(xì)胞相比，兩種組成性激活型AMPK過(guò)表達(dá)的血管平滑肌細(xì)胞中，由IGF-1刺激引起的細(xì)胞增生均受到明顯抑制(圖2D)。提示AMPK活性能抑制由IGF-1刺激引起的血管平滑肌細(xì)胞增生，其抑制作用可能通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi)ERK1/2活化來(lái)達(dá)成。

2.3 敲低AMPK增強(qiáng)IGF-1刺激引起的ERK1/2活化

為進(jìn)一步證實(shí)AMPK活性能抑制細(xì)胞內(nèi)ERK1/2活化，用降低細(xì)胞內(nèi)AMPK表達(dá)的方法觀察是否能增強(qiáng)IGF-1刺激引起的ERK1/2活化。構(gòu)建了3種敲低AMPK的慢病毒載體：Si-AMPK1、2、3，并分別感染血管平滑肌細(xì)胞，結(jié)果顯示，3種病毒感染均能明顯降低細(xì)胞內(nèi)AMPK表達(dá)水平(圖3A)。選用降低AMPK表達(dá)效率最高的Si-AMPK3病毒感染做進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，與空載體包裝的病毒感染相比， 降低AMPK表達(dá)能明顯增強(qiáng)IGF-1刺激引起的血管平滑肌細(xì)胞ERK1/2活化，這進(jìn)一步證明AMPK活性能抑制ERK1/2活化(圖3B)。

3 討論

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們生活水平的提高，與環(huán)境因素、生活方式及人口老齡化密切相關(guān)的慢性非傳染性疾病動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病率逐漸上升。動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病過(guò)程中，在脂質(zhì)代謝異常、血管內(nèi)皮損傷等多因素協(xié)同下，血管平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化發(fā)揮了重要作用。血管平滑肌細(xì)胞由合成能力強(qiáng)、增生能力弱的分化型向合成能力弱、增生能力強(qiáng)的去分化型的表型轉(zhuǎn)化，并發(fā)生細(xì)胞增生和遷移是動(dòng)脈粥樣硬化的特征性病變[8-9]，因此，研究血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制，對(duì)于充分認(rèn)識(shí)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展規(guī)律，從而提出有效防治措施具有重要意義。

動(dòng)脈粥樣硬化中血管平滑肌細(xì)胞的病理性改變受到包括IGF-1在內(nèi)的多種生長(zhǎng)因子的調(diào)控[1]，IGF-1刺激引起的AKT信號(hào)通路活化對(duì)于促進(jìn)細(xì)胞增生、運(yùn)動(dòng)發(fā)揮重要作用，本課題組前期報(bào)道了AMPK通過(guò)直接磷酸化IRS-1 第794位絲氨酸引起PI3K活性抑制，進(jìn)而抑制AKT活化，從而對(duì)血管平滑肌細(xì)胞中IGF-1信號(hào)通路起負(fù)性調(diào)控作用[5]。IGF-1刺激除了能引起AKT活化外，還能引起ERK1/2的活化[10]。AMPK對(duì)血管平滑肌細(xì)胞ERK1/2活性的影響以及AMPK是否能夠通過(guò)抑制ERK1/2活化發(fā)揮對(duì)血管平滑肌細(xì)胞IGF-1信號(hào)通路的負(fù)性調(diào)控作用，國(guó)內(nèi)外報(bào)道較少。本研究中，本課題組通過(guò)使用AMPK激活劑二甲雙胍處理、組成性激活型AMPK慢病毒感染及敲低AMPK慢病毒感染等方法，證明AMPK活化能夠?qū)е卵芷交〖?xì)胞IGF-1刺激引起的ERK1/2活性降低，并進(jìn)而抑制細(xì)胞增生。

圖2 組成性激活型AMPK抑制IGF-1刺激引起的ERK1/2活化及細(xì)胞增生Fig.2 Constitutively active AMPK suppresses ERK1/2 activation and cells proliferation stimulated by IGF-1

圖3 敲低AMPK增強(qiáng)IGF-1刺激引起的ERK1/2活化Fig.3 Knock-down of AMPK enhances ERK1/2 activation stimulated by IGF-1

A:Porcinevascular smooth muscle cells (pSMC) were transduced with empty vector (Si-EVT) or three different AMPK short hairpin RNA templates(Si-AMPK 1,2,3). The cells were analyzed for AMPK protein expression. The cell lysates were immunoblotted with an anti-AMPK or an anti-β-actin antibody.B:Porcinevascular smooth muscle cells (pSMC) transduced with Si-EVT or Si-AMPK was incubated in serum-free medium for 20 h followed by IGF-1 (20 ng/mL) for 10 min. The cell lysates were immunoblotted with antibodies indicated, respectively.AMPK：AMP-activated protein kinase；IGF-1：insulin like growth factor-1；ERK1/2：extracellular signal-regulated kinases 1/2;p-ERK1/2：phospho-extracellular signal-regulated kinases 1/2.

AMPK活化對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展有明顯抑制作用，其機(jī)制涉及多個(gè)方面，有文獻(xiàn)[11]報(bào)道AMPK通過(guò)抑制氧化應(yīng)激過(guò)程來(lái)抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞AMPK活性明顯增強(qiáng)軟脂酸鹽誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激(oxidation stress)；與ApoE基因敲除小鼠相比，AMPKα2與ApoE聯(lián)合基因敲除小鼠血清三酰甘油濃度明顯增加，動(dòng)脈粥樣硬化病灶面積明顯增大。進(jìn)一步的研究[12]顯示，AMPKα2通過(guò)維持肌漿網(wǎng)鈣泵(sarcoendoplasmic reticulum calcium ATPase， SERCA)活性來(lái)保持細(xì)胞內(nèi)Ca2+動(dòng)態(tài)平衡，從而抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并認(rèn)為AMPKα2通過(guò)此種機(jī)制抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。Vasamsetti等[13]的研究提示，AMPK還能通過(guò)STAT3通路抑制單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞的分化，從而抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。因此，AMPK對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的抑制是多種途徑共同作用的結(jié)果[14]。本研究提示AMPK抑制生長(zhǎng)因子信號(hào)活性，從而抑制血管平滑肌細(xì)胞的增生；另外,AMPK對(duì)生長(zhǎng)因子信號(hào)的抑制，可作用于生長(zhǎng)因子及其受體下游多條信號(hào)通路，為AMPK抑制動(dòng)脈粥樣硬化提供新的理論依據(jù)。