王 蔚 蘇嘉明 袁東波 張 偉 陳衛(wèi)紅 孫兆林 朱建國(guó)*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)研究生院，貴陽(yáng) 550000；2.貴州省人民醫(yī)院泌尿外科，貴陽(yáng) 550000；3.遵義醫(yī)科大學(xué)研究生院，貴州遵義 563000)

前列腺癌(prostate cancer，PCa)已成為危害男性健康的主要惡性腫瘤之一，在歐美發(fā)達(dá)國(guó)家及地區(qū)，其發(fā)病率已躍居至男性惡性腫瘤發(fā)病率的首位[1-2]。根據(jù)最新的10年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，PCa在大多數(shù)國(guó)家的發(fā)病率急劇上升，其中尤以亞洲、北歐和西歐地區(qū)的增長(zhǎng)最為快速[3]。我國(guó)前列腺癌的發(fā)病率雖然較低，但其趨勢(shì)卻不容樂(lè)觀(guān)，伴隨著我國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展，人們生活及飲食習(xí)慣的改變，人口老齡化日益加劇，PCa的發(fā)病率也在不斷上升且增長(zhǎng)的速度更為快速，現(xiàn)已成為我國(guó)男性泌尿生殖系統(tǒng)中最常見(jiàn)的惡性腫瘤[4]。前列腺癌的病因尚不明確，可能與種族、遺傳、環(huán)境、食物、吸煙、肥胖、性激素等有關(guān)。其發(fā)生發(fā)展是由多種因素誘導(dǎo)的復(fù)雜過(guò)程，受到體內(nèi)、外各種因素的作用和影響。許多研究[5-7]證明某些基因的功能丟失或突變?cè)谇傲邢侔┑陌l(fā)病、進(jìn)展及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。因此尋找早期診斷前列腺癌、評(píng)估遠(yuǎn)期預(yù)后的分子標(biāo)志物是前列腺癌基礎(chǔ)研究的一個(gè)熱點(diǎn)方向。

MAP1A是微管相關(guān)蛋白(microtubule-associated proteins，MAPs)家族中重要的一員，附著于微管多聚體上，參與微管組裝并增加微管穩(wěn)定性[8]，其在細(xì)胞增生、分化、自噬、遷移和腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演了十分重要的角色。本研究采用免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IHC)染色、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction, RT-qPCR)檢測(cè)MAP1A基因在前列腺癌及正常前列腺組織中的表達(dá)情況，進(jìn)一步通過(guò)癌癥基因信息數(shù)據(jù)庫(kù)(the Cancer Genome Atlas, TCGA)分析MAP1A的表達(dá)與臨床病理等參數(shù)之間的相關(guān)性，探討MAP1A在前列腺癌中的表達(dá)情況及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 組織芯片

采用前列腺癌患者組織芯片進(jìn)行IHC，檢測(cè)MAP1A在99例前列腺癌及81例癌旁正常前列腺組織樣本中的表達(dá)差異。組織芯片購(gòu)自上海芯超生物科技有限公司(芯片編號(hào)：FM-S4006-1，芯片批號(hào)：HPro-Ade180PG-01)，組織芯片排列包含了99例原發(fā)前列腺癌患者的前列腺癌組織和81例癌旁正常前列腺組織。99例前列腺癌患者年齡50～90歲，平均年齡(70.71±7.98)歲。組織芯片包括了181個(gè)位點(diǎn)(其中1個(gè)為定位點(diǎn))，均無(wú)組織芯片脫落。所有組織均經(jīng)直腸前列腺13點(diǎn)穿刺或臨床手術(shù)切除后經(jīng)病理證實(shí)為前列腺癌，患者在術(shù)前均沒(méi)有接受抗雄激素去勢(shì)治療及放射治療(以下簡(jiǎn)稱(chēng)放療)和化學(xué)藥物治療(以下簡(jiǎn)稱(chēng)化療)。臨床病理參數(shù)信息包括有：年齡、Gleason評(píng)分、腫瘤大小、病理分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移檢測(cè)等，同時(shí)本組織芯片沒(méi)有隨訪(fǎng)信息。

1.2 免疫組織化學(xué)染色

按照SP試劑盒的操作說(shuō)明進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，樣本使用二甲苯脫石蠟并用梯度乙醇再水化，3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的過(guò)氧化氫離子水用于滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，檸檬酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，使用5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)孵育載玻片以阻斷非特異性結(jié)合，隨后分別進(jìn)行與第一抗體及第二抗體的孵育；最后通過(guò)應(yīng)用過(guò)氧化物酶復(fù)合物試劑和3,3’-二氨基聯(lián)苯胺溶液實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)可視化。最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果由兩位病理醫(yī)師根據(jù)以下判定標(biāo)準(zhǔn)獨(dú)立地進(jìn)行盲評(píng)。免疫組化結(jié)果評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占的比例和細(xì)胞染色強(qiáng)度兩個(gè)方面分別計(jì)分[細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃或棕褐顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞]: 無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞評(píng)0分, 陽(yáng)性細(xì)胞≤25 %評(píng)1分，26%～50%評(píng)2分，51%～75 %評(píng)3分，>75 %評(píng)4分。著色強(qiáng)度無(wú)色評(píng)0分, 淡黃色評(píng)1分，棕黃色評(píng)2分, 棕褐色評(píng)3分。最終免疫組化評(píng)分(immunoreactive score, IRS)結(jié)果為兩者評(píng)分的相加總分，0分為陰性(-), 2～3分為弱陽(yáng)性(±)，4～5分為陽(yáng)性(+)，6～7分為強(qiáng)陽(yáng)性(+ +)；其中(+) 和(+ +) 判為陽(yáng)性結(jié)果。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

該研究經(jīng)貴州省人民醫(yī)院研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào)：2016026)。從貴州省人民醫(yī)院的組織庫(kù)收集了6例原發(fā)性PCa組織和6例正常前列腺組織的樣品。所有標(biāo)本均按照道德和法律標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行匿名處理，患者同意和簽訂患者知情同意書(shū)。上述樣本為前列腺根治術(shù)或經(jīng)尿道前列腺電切術(shù)以及膀胱癌根治術(shù)時(shí)手術(shù)切下的前列腺組織，術(shù)后立即放液氮速凍，-80°保存?zhèn)溆谩１狙芯恐姓心嫉幕颊呔丛谑中g(shù)前進(jìn)行化療或放療，所有冰凍樣本都經(jīng)蘇木精-伊紅染色(hematoxylin eosin staining，HE)鑒定，符合要求才進(jìn)一步提取RNA。使用天根RNA試劑盒(CatNo.DP419，TianGene，China)提取總RNA，并通過(guò)UV分光光度計(jì)NanoDrop 2000(Thermo Scientific，USA)測(cè)量總RNA的濃度。 RT-qPCR用于檢查基質(zhì)mRNA在基質(zhì)組織中的表達(dá)狀態(tài)。qPCR檢測(cè)采用SYBR Green?染料法，反應(yīng)條件參數(shù)為：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性15 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。所有測(cè)定一式三份進(jìn)行，使用IQ5軟件(Bio-Rad)測(cè)定循環(huán)閾值(cycle threshold,Ct)值。用GAPDH表達(dá)對(duì)每個(gè)樣品中的基因表達(dá)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。使用比較Ct值評(píng)估靶基因表達(dá)的相對(duì)定量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0軟件處理，臨床病理參數(shù)之間MAP1A的表達(dá)水平比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；若方差不齊則采用近似t檢驗(yàn)。前列腺癌及癌旁正常組織間MAP1A陽(yáng)性表達(dá)率的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MAP1A蛋白在前列腺癌組織中的表達(dá)

結(jié)果顯示，MAP1A在前列腺癌及癌旁組織中均主要表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)染色，MAP1A在前列腺腫瘤細(xì)胞質(zhì)中的免疫組化染色強(qiáng)度主要為弱陽(yáng)性和中度陽(yáng)性，而在癌旁正常前列腺組織中免疫組化染色強(qiáng)度多為強(qiáng)陽(yáng)性和中度陽(yáng)性(圖1A、C)。組織芯片IRS評(píng)分結(jié)果顯示，MAP1A在前列腺癌組織中的表達(dá)(4.08±1.58)顯著低于癌旁正常組織(4.91±1.46)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-3.699，P<0.001)(圖1B)。通過(guò)IRS評(píng)分進(jìn)一步檢測(cè)組織芯片中MAP1A的陽(yáng)性表達(dá)率，將0～3分定義為陰性表達(dá)，4～7分定義為陽(yáng)性表達(dá)。結(jié)果顯示，在99例前列腺癌組織中58例呈陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率為58.6%；而在81例癌旁良性組織中有67例染色呈陽(yáng)性，陽(yáng)性率為82.7%；兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.225，P=0.001)。

對(duì)99例前列腺癌患者M(jìn)AP1A的表達(dá)水平與其臨床特征進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的結(jié)果顯示，在不同臨床病理分期的前列腺癌組織中，MAP1A的表達(dá)水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-2.678，P=0.003)，腫瘤的臨床病理分期越晚，則前列腺癌組織中MAP1A的表達(dá)越低；而在不同年齡(t=1.661，P=0.100)和不同Gleason評(píng)分(t=-0.925，P=0.357)的前列腺癌組織中MAP1A的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見(jiàn)表1。

圖1 MAP1A蛋白在前列腺癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)Fig.1 Expression of MAP1A protein in prostate cancer tissues and adjacent normal tissues

A：immunohistochemistry results of MAP1A in tissue microarrays；B：immunoreactive score；C：the expression of MAP1A (immunohistochemistry staining, 10×,20×)；* * *P<0.001； Red arrows show the positive staining cells；MAP1A:microtubule associated protein 1A;TMA：tissue microarrays；IRS:immunoreactive score;Cancer：the prostate cancer group；Normal：the adjacent normal tissues group.

*P<0.05；MAP1A:microtubule associated protein 1A;IRS:immunoreactive score.

2.2 MAP1A mRNA在前列腺癌及正常前列腺組織中的表達(dá)情況

應(yīng)用RT-qPCR檢測(cè)前列腺癌組織(n=6)和正常前列腺組織(n=6)中MAP1A mRNA表達(dá)量。以MAP1A基因的反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列為(F: 5′-GAGAGGCTTCCTCCTACACC-3′ R：5′-GTCTCCCCCAGGCTCTAAAC-3′)，結(jié)果在186bp擴(kuò)增到清晰條帶，與預(yù)期的片段大小一致(圖2A)。圖2B中結(jié)果可見(jiàn)，MAP1A mRNA在前列腺癌中的表達(dá)量為正常前列腺組織中表達(dá)量的0.81倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.019)，即MAP1A mRNA在PCa組織中表達(dá)顯著低于正常前列腺組織。

2.3 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中MAP1A的表達(dá)降低與前列腺癌的侵襲性進(jìn)展和預(yù)后的關(guān)系

為了進(jìn)一步驗(yàn)證MAP1A表達(dá)情況與前列腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系，對(duì)TCGA公共數(shù)據(jù)庫(kù)中497例前列腺癌患者M(jìn)AP1A mRNA表達(dá)水平與其臨床病理特征進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示，MAP1AmRNA的表達(dá)在不同臨床特征的腫瘤組織中差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即Gleason評(píng)分高，病理分期晚，發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者體內(nèi)MAP1A表達(dá)量更低，表明MAP1A在前列腺癌中表達(dá)水平低，則患者臨床預(yù)后較差，詳見(jiàn)表2。

3 討論

前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展是由眾多因素的改變引起的，許多研究[9-11]表明前列腺癌的預(yù)后與確診時(shí)前列腺癌的分期具有直接的相關(guān)性，因此早期診斷對(duì)患者的治療和預(yù)后有重大意義。前列腺癌的診斷手段包括：直腸指檢、血清前列腺特異性抗原 (prostate specific antigen，PSA) 檢測(cè)、前列腺B超和盆腔磁共振(magnetic resonance imaging,MRI)檢查等方式[12]，其中血清PSA檢測(cè)在臨床上最為常用，通過(guò)評(píng)估血清PSA濃度，大多數(shù)患者在癌癥早期可通過(guò)前列腺穿刺明確診斷[13-14]。但PSA濃度可受到諸多因素的影響，如年齡、前列腺肥大、前列腺炎、導(dǎo)尿術(shù)和膀胱鏡檢查后、前列腺穿刺活檢或前列腺手術(shù)后等，都將導(dǎo)致不同程度的升高，因此缺乏前列腺癌的特異性。此外，當(dāng)PSA處于4～10 ng/mL的灰度區(qū)間時(shí)，仍有25%的患者可能為前列腺癌，而PSA<4 ng/mL時(shí)也有15%患者可能是前列腺癌[15-16]。因此單純依靠PSA進(jìn)行篩查可發(fā)生前列腺癌的過(guò)度診療及患者生活質(zhì)量下降的問(wèn)題，故不能把穿刺活檢應(yīng)用于大樣本人群的篩查和早期診斷[17-18]。目前PCa的診療方案及遠(yuǎn)期預(yù)后主要取決于疾病的臨床病理學(xué)特征，例如腫瘤分期、血清PSA濃度、手術(shù)邊緣狀態(tài)和Gleason評(píng)分等[19-20]。前列腺癌的遠(yuǎn)期預(yù)后及生存率有賴(lài)于早期診斷和早期治療，而PCa的臨床進(jìn)展是從無(wú)痛或無(wú)臨床意義的惰性腫瘤到侵襲性、轉(zhuǎn)移性的致死性疾病。據(jù)統(tǒng)計(jì)[21]，發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的侵襲性PCa患者的5年相對(duì)生存率為28%，而局部或區(qū)域性的惰性低風(fēng)險(xiǎn)PCa患者的存活率則接近100%。對(duì)于惰性的低風(fēng)險(xiǎn)腫瘤患者來(lái)說(shuō)，采用積極監(jiān)測(cè)的保守治療方式可能比手術(shù)治療更能保證其生命質(zhì)量[22]。因此臨床上需要一種精準(zhǔn)的腫瘤標(biāo)志物來(lái)補(bǔ)充及提高前列腺癌的診斷率，并能有效地區(qū)分惰性和侵襲性病例，從而確定最佳的治療策略。

圖2 MAP1A在前列腺癌及正常前列腺組織中的RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果Fig.2 RT-qPCR results of MAP1A in prostate cancer and normal prostate tissue

A: The electrophoresis of PCR product for MAP1A；B: Histogram for the relative expression levels for MAP1A;*P<0.05；MAP1A:microtubule associated protein 1A;MAP1A-Normal: the normal prostate tissues group；MAP1A-Cancer: the prostate cancer group；GAPDH: internal reference.

表2 TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中前列腺癌患者M(jìn)AP1A mRNA表達(dá)與臨床特征的關(guān)系Tab.2 Associations of MAP1A mRNA expression with clinical characteristics of prostate patients

MAPs和微管蛋白是組成微管的主要成分，微管是細(xì)胞骨架的主要結(jié)構(gòu)成分之一，參與細(xì)胞的許多生理功能：維持細(xì)胞正常的形態(tài)，作為細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸?shù)耐ǖ?，參與纖毛、鞭毛的運(yùn)動(dòng)，還在細(xì)胞分裂、細(xì)胞周期、細(xì)胞增生、細(xì)胞自噬過(guò)程中發(fā)揮重要作用[23]。微管相關(guān)蛋白 1(MAP1)是MAPs家族中的經(jīng)典成員之一，哺乳動(dòng)物基因組通常包含3個(gè)家族成員：MAP1A、MAP1B和MAP1S。MAP1A主要分布在神經(jīng)元的軸突和樹(shù)突中，可以參與微管組裝、調(diào)節(jié)微管運(yùn)動(dòng)及穩(wěn)定性并促進(jìn)微管聚合成束，對(duì)軸突、樹(shù)突的生長(zhǎng)發(fā)育發(fā)揮重要作用[24-25]。研究[26-27]表明MAP1與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。如Meyer等[26]研究發(fā)現(xiàn)MAP1A可在膠質(zhì)瘤中抑制腫瘤細(xì)胞增生，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲等作用。Knutson等[27]發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于正常乳腺組織及血液，MAP1A在乳腺癌中上調(diào)表達(dá)，其作為孕酮受體的下游靶基因，可聯(lián)合預(yù)測(cè)乳腺癌早期轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后事件的發(fā)生，從而作為乳腺癌潛在的內(nèi)分泌治療靶點(diǎn)。Jiang等[28]發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌中，MAP1S和富含亮氨酸的三角狀五肽重復(fù)結(jié)構(gòu)蛋白(leucine rich pentatricopeptide repeat containing，LRPPRC)可以協(xié)同調(diào)控前列腺細(xì)胞自噬，作為前列腺癌患者預(yù)后的標(biāo)志物。本研究顯示，相比于癌旁正常前列腺組織，MAP1A蛋白在前列腺癌組織中的表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.001)。同時(shí)組織芯片結(jié)果顯示，MAP1A在前列腺癌旁正常組織中陽(yáng)性表達(dá)率為82.7%，在癌組織中表達(dá)率為58.6%，說(shuō)明其可作為提高前列腺癌診斷率的一種輔助標(biāo)志物。RT-qPCR結(jié)果進(jìn)一步表明，MAP1A mRNA在正常前列腺組織中的表達(dá)顯著高于前列腺癌組織，這說(shuō)明MAP1A的異常表達(dá)在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展中可能扮演著重要的角色。但是因本資料入組樣本有限，關(guān)于MAP1A在前列腺癌診斷中的價(jià)值及作用，還需要進(jìn)行驗(yàn)證。因此筆者進(jìn)一步使用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析MAP1A的表達(dá)與前列腺癌患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系，結(jié)果顯示，MAP1A的表達(dá)與患者的年齡無(wú)關(guān)，但在不同Gleason評(píng)分(P<0.001)、臨床病理分期(P=0.009)、轉(zhuǎn)移(P=0.008)、總體生存率(P=0.049)的腫瘤組織中，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MAP1A的表達(dá)越低，腫瘤分化越差、病理分期越晚，故惡性程度越高，同時(shí)腫瘤患者的遠(yuǎn)期生存率也越低。因此綜上所述，筆者推測(cè)MAP1A在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮著重要的作用。

總之，本研究拓展了臨床科研工作者對(duì)MAP1A在前列腺癌中的研究認(rèn)識(shí)，MAP1A在前列腺腫瘤組織中表達(dá)顯著下調(diào)，其表達(dá)與臨床特征顯著相關(guān)。通過(guò)對(duì)術(shù)后腫瘤組織中MAP1A的檢測(cè)，可能有助于提高前列腺癌診斷的準(zhǔn)確性并有效地區(qū)分惰性和侵襲性疾病，是對(duì)患者的預(yù)后評(píng)估及指導(dǎo)治療的一個(gè)重要的潛在靶點(diǎn)，但這還需在未來(lái)進(jìn)行大樣本的臨床驗(yàn)證。