桂 蘭， 于瑞濤， 吳 楠， 王衛(wèi)東， 梅麗娟?

（1. 中國科學(xué)院西北高原生物研究所， 中國科學(xué)院藏藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 青海省藏藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧810008； 2. 中國科學(xué)院大學(xué)， 北京100049）

乳白香青Anaphalis lactea Maxim. 為菊科香青屬多年生草本植物， 主要分布在甘肅南部、 青海及四川西北部， 在青海為民間草藥， 又名“哇日多羅”， 可治頭痛［1］， 具有祛痰、 止血活血、 祛風(fēng)濕、 消痞瘤、 平肝潛陽、 平喘， 以及治療風(fēng)寒感冒、 胃潰瘍等功效［2-3］， 主要含有黃酮類、 皂苷類、 萜類等成分［4］， 其中黃酮類化合物有抗腫瘤、 抗氧化、 抗輻射等作用［5-6］。 前期報(bào)道， 乳白香青總黃酮具有很好的的抗氧化活性［4，7］； 袁彥平等［8］對乳白香青煎劑、 蒸餾液、 黃酮和全草注射液進(jìn)行了動物實(shí)驗(yàn)研究， 發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物具有一定的鎮(zhèn)咳作用和比較明顯的祛痰作用。 根據(jù)質(zhì)量標(biāo)志物（Q-marker） 新概念［9］并參考相關(guān)研究［10］，黃酮醇苷為乳白香青中主要活性成分， 故本實(shí)驗(yàn)將其作為該藥材的Q-marker。

目前， 國內(nèi)報(bào)道黃酮醇苷含有量的檢測方法主要有紫外分光光度法［7，11］、 薄層掃描法、 HPLC 法、 熒光分光光度法、 毛細(xì)管電泳法等， 本實(shí)驗(yàn)采用HPLC 法， 具有分離效率高、 分析速度快、 靈敏度高等特點(diǎn)［12］。 另外， 對乳白香青總黃酮醇苷的研究較少， 并且尚無通過HPLC 法測定其含有量的報(bào)道， 故本實(shí)驗(yàn)建立該方法測定該成分含有量，以期為乳白香青質(zhì)量評價(jià)與開發(fā)利用提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC-20A 高效液相色譜儀［島津企業(yè)管理（中國） 有限公司］； XS105 電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）； HH-4 恒溫水浴鍋 （常州國華電器有限公司）；UPI-1-520T 超純水器（成都超純科技有限公司）。

1.2 試藥 槲皮素 （批號1100812200205， 含有量＞98%）、 山柰素（批號1108612200606， 含有量＞98%）、 異鼠李素（批號1108612200407， 含有量＞98%） 對照品（中國食品藥品檢定研究院）。 9 批乳白香青于2011 年7 ～8 月采自青海省， 經(jīng)中國科學(xué)院西北高原生物研究所梅麗娟研究員鑒定為正品（具體信息見表1）。 甲醇為色譜純（江蘇漢邦科技有限公司）； 其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Unitary C18色譜柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動相甲醇-0.4% 磷酸水（45 ∶55）， 等度洗脫（50 min）； 柱溫35 ℃； 體積流量1.0 mL／min； 檢測波長365 nm； 進(jìn)樣量10 μL。 色譜圖見圖1。

表1 樣品信息

圖1 各成分HPLC 色譜圖

2.2 供試品溶液制備 精密稱取干燥過篩的藥材粉末約0.21 g， 置于250 mL 圓底燒瓶中， 加甲醇-25%鹽酸（4 ∶1） 混合溶液10 mL， 稱定質(zhì)量， 加熱回流60 min， 甲醇-25%鹽酸（4 ∶1） 補(bǔ)足減失的質(zhì)量， 搖勻， 濾過， 取續(xù)濾液， 即得。

2.3 對照品溶液制備 分別精密稱取槲皮素、 山柰素、 異鼠李素對照品3.02、 4.84、 3.20 mg， 置于50 mL 量瓶中，加甲醇40 mL， 超聲處理5 min， 甲醇稀釋至刻度，0.45 μm微孔濾膜過濾， 即得， 4 ℃保存， 備用。

2.4 線性關(guān)系考察 精密量取對照品溶液0.05、 0.5、1.0、 2.5、 5.0、 10 mL， 置于10 mL 量瓶中， 甲醇定容至刻度， 搖勻， 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下測定3 次。 以峰面積為縱坐標(biāo)（Y）， 溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X） 進(jìn)行線性回歸， 結(jié)果見表2， 可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取對照品溶液10 μL， 在“2.1”項(xiàng)色譜條件下測定， 測得槲皮素、 山柰素、 異鼠李素峰面積RSD 分別為0.61%、 0.96%、 0.53%， 表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液， 于0、 2、4、 8、 12、 24 h 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下測定， 測得槲皮素、 山柰素、 異鼠李素峰面積RSD 分別為1.37%、 2.38%、2.63%， 表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批藥材5 份， 每份約0.21 g， 按“2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 過濾， 精密吸取10 μL，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下測定， 測得槲皮素、 山柰素、 異鼠李素含有量RSD 分別為2.71%、 1.53%、 2.42%， 表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取各成分含有量已知的供試品溶液9 份， 精密加入一定量對照品溶液， 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下測定， 計(jì)算回收率， 結(jié)果見表3。

表3 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）

2.9 樣品含有量測定 取不同產(chǎn)地藥材各5 份， 按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 過濾， 精密吸取10 μL， 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下測定， 計(jì)算含有量， 同時計(jì)算總黃酮醇苷含有量［（槲皮素含有量＋山柰素含有量＋異鼠李素含有量） × 2.51］［13］， 結(jié)果見表4。

表4 各成分含有量測定結(jié)果（mg／g， n＝5）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)考察了不同比例甲醇-0.4% 磷酸 （50 ∶ 50、48 ∶52、 45 ∶55）， 發(fā)現(xiàn)兩者比例在45 ∶55 時， 各色譜峰的分離度、 對稱性和理論塔板數(shù)良好， 結(jié)果可靠。 在2015年版《中國藥典》 中， 槲皮素、 山柰素、 異鼠李素的最大吸收波長均在365 nm 左右， 此波長下色譜峰響應(yīng)較高， 與其他雜質(zhì)峰分離度符合要求， 故本實(shí)驗(yàn)確定其作為檢測波長。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， 不同產(chǎn)地乳白香青中3 種黃酮醇苷的含有量明顯存在差異， 其中共和縣、 互助縣南門峽、 祁連縣冰大坂產(chǎn)者依次為槲皮素＞山柰素＞異鼠李素； 天峻縣舟群鄉(xiāng)、 瑪沁縣果洛軍牧場、 互助縣北山、 祁連縣卓爾山、祁連縣阿柔鄉(xiāng)、 祁連縣油葫蘆溝產(chǎn)者依次為山柰素＞槲皮素＞異鼠李素； 僅天峻縣舟群鄉(xiāng)、 瑪沁縣果洛軍牧場、 共和縣、 互助縣南門峽產(chǎn)者檢測出異鼠李素， 而且含有量很低； 總黃酮醇苷含有量依次為瑪沁縣果洛軍牧場＞天峻縣舟群鄉(xiāng)＞共和縣＞互助縣北山＞祁連縣冰大坂＞祁連縣卓爾山＞互助縣南門峽＞祁連縣油葫蘆溝＞祁連縣阿柔鄉(xiāng)， 并且前2個產(chǎn)地藥材中該成分含有量均高于《中國藥典》 規(guī)定的銀杏葉總黃酮醇苷含有量［13］。 由此可知， 乳白香青中總黃酮醇苷含有量與海拔高度不呈線性關(guān)系， 可能與其生長環(huán)境有關(guān)。