曹 峰， 羅振亮， 秦 源， 丁 然， 唐阿梅， 劉 楊

（貴陽中醫(yī)學(xué)院， 貴州 貴陽550025）

功能性消化不良是一種常見的消化系統(tǒng)疾病， 患者胃部并無明顯器質(zhì)性病變， 但有腹部疼痛或不適、 飽脹、 噯氣不舒、 嘔逆等臨床癥狀， 而且胃腸動力明顯不足， 進食減少， 其發(fā)病原因和機制復(fù)雜不明。 《傷寒論》 中茯苓甘草湯功效溫胃化飲、 通陽利水， 主治心下悸、 四肢不溫、胃中痞滿、 漉漉有水聲、 舌淡苔滑， 這與功能性消化不良之中醫(yī)證候的胃虛飲停證較相似。 課題組前期發(fā)現(xiàn)， 茯苓甘草湯對功能性消化不良大鼠乙酰膽堿酯酶活性有激活作用［1］， 故本實驗以此為基礎(chǔ)， 進一步考察該方針對功能性消化不良改善作用的潛在靶點。

1 材料

1.1 藥物 茯苓甘草湯中的茯苓、 桂枝、 甘草、 生姜購自貴州同濟堂藥業(yè)有限公司， 經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院董麗莎教授鑒定為正品。 按《傷寒論》 原方， 取茯苓2 兩（30 g）、 桂枝2兩（30 g）、 炙甘草1 兩（15 g）、 生姜3 兩（45 g）， 配伍后打粉， 過100 目篩， 10 倍蒸餾水煎煮1 次， 8 倍蒸餾水煎煮2 次， 過濾后合并濾液， 60 ℃下緩慢蒸發(fā)至所需濃度溶液后保存?zhèn)溆茫? mL 相當于原方劑藥材量1 g）。 多潘立酮片，批號170306533， 由西安楊森制藥有限公司提供。

1.2 動物 SD 大鼠， 雌雄各半， 體質(zhì)量180～220 g， 由長沙天勤生物技術(shù)有限公司提供， 動物許可證號SCXK（湘） -2014-0011， SPF 級環(huán)境飼養(yǎng)， 室溫20～26 ℃， 實驗動物倫理委員會批準編號1509005， 動物飼料也由上述單位提供。

1.3 試劑 AQP4、 Leptin、 eNOS、 β-actin 抗 體， 貨 號ab9512、 ab117751、 ab76198、 ab8227， 由英國Abcam 公司提 供； ZO-2、 YAP、 CGRP 抗 體， 貨 號 2847、 4912、14959， 由美國CST 公司提供； 山羊抗兔HRG 抗體， 批號109525， 由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供。 SDSPAGE 凝膠制備試劑盒， 貨號G1120； BCA 蛋白濃度定量試劑盒， 貨號PC0020； ECL 發(fā)光劑， 貨號PE0010， 由北京索萊寶生物科技有限公司提供。

1.4 儀器 電子數(shù)顯游標卡尺， 由上海美耐特五金工具公司提供； KD-202A 石蠟切片機， 由浙江科迪儀器設(shè)備有限公司提供； CX21 型光學(xué)顯微鏡， 由日本Olympus 公司提供。

2 方法

2.1 分組及給藥 60 只大鼠隨機分為空白組、 模型組、茯苓 甘 草 湯 組 （ 20、 10、 5 g／kg）、 多 潘 立 酮 組（0.004 g／kg）， 每組10 只， 空白組大鼠灌胃給予常溫生理鹽水， 其余各組大鼠給予0 ℃、 0.5 mol／L 稀鹽酸誘導(dǎo)功能性消化不良模型［1］。 14 d 后， 正常組、 模型組大鼠給予常溫生理鹽水， 其余各組大鼠給予常溫相應(yīng)濃度藥物， 每天灌胃給藥1 次， 連續(xù)7 d， 末次給藥1 h 后， 檢測各組大鼠腸推進功能， 并取胃組織置于4%多聚甲醛中， -80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 大鼠腸推進功能測定 各組大鼠末次給藥前禁食8 h后， 給予半流質(zhì)飼料和碳粉混合物， 2 g／只， 10 min 后藥物干預(yù)， 30 min 后取小腸平鋪， 測量半流質(zhì)飼料和碳粉混合物從幽門括約肌推動到回盲部的距離， 進行記錄和統(tǒng)計分析。

2.3 大鼠胃組織AQP4、 Leptin、 eNOS 蛋白表達檢測 采

用免疫組化法。 大鼠胃組織用自來水沖洗4 h， 不同體積分數(shù)乙醇（由低到高） 各脫水1 h， 二甲苯透明2 次， 每次20 min， 液體石蠟中浸泡2 次， 每次1.5 h， 包埋； 切片機上切片， 常規(guī)二甲苯脫蠟2 次， 每次15 min， 不同體積分數(shù)乙醇（由高到低） 水化， PBS 浸泡后3% 過氧化氫封閉10 min 以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶， PBS 沖洗后滴加Ⅰ抗，4 ℃孵育后滴加Ⅱ抗， DAB 顯影后， 自來水沖洗， 復(fù)染，脫水， 透明， 封片。

2.4 大鼠胃組織ZO-2、 YAP、 CGRP 蛋白表達檢測 采用蛋白印跡法。 BCA 蛋白定量試劑盒蛋白定量后， SDS-PAGE凝膠制備試劑盒制備12% 分離膠和5% 濃縮膠， 上樣后電泳1 h， 轉(zhuǎn)膜2 h， 5%脫脂奶粉封閉2 h 后加Ⅰ抗， 其中內(nèi)參Ⅰ抗1 ∶8 000、 其他Ⅰ抗1 ∶3 000， TBST 沖洗3 次， 加入Ⅱ抗1 ∶7 000， TBST 沖洗3 次， ECL 發(fā)光液顯影。

2.5 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS17.0 軟件進行處理， 數(shù)據(jù)以（±s）表示， 組間比較采用非參數(shù)秩和檢驗。 以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)差異。

3 結(jié)果

3.1 茯苓甘草湯對大鼠腸推進功能的影響 與空白組比較， 模型組大鼠腸功能推進距離顯著縮短（P＜0.01）； 與模型組比較， 茯苓甘草湯20、 10 g／kg 組其距離顯著增加（P＜0.01）。 見表1。

表1 茯苓甘草湯對大鼠腸推進功能的影響（±s， n＝8）

表1 茯苓甘草湯對大鼠腸推進功能的影響（±s， n＝8）

注：與空白組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，??P＜0.01

組別 劑量／（g·kg-1）腸功能推進距離／mm空白組 — 23.53±5.58??模型組 — 15.71±2.57＃＃茯苓甘草湯組 20 23.06±4.21??茯苓甘草湯組 10 21.86±3.88??茯苓甘草湯組 5 19.96±5.91多潘立酮組 0.004 23.16±3.94??

3.2 茯苓甘草湯對大鼠胃組織AQP4、 Leptin、 eNOS 蛋白表達的影響 AQP4、 Leptin、 eNOS 蛋白大多表達于胃黏膜腺泡內(nèi)（圖1～3）； 與模型組比較， 茯苓甘草湯各劑量組AQP4 蛋白表達顯著升高（P＜0.05， P＜0.01）， Leptin 蛋白表達顯著降低（P＜0.05）， 并且20、 10 g／kg 組eNOS 蛋白表達也顯著降低（P＜0.05， P＜0.01）。 見表2 （以光密度表示）。

圖1 茯苓甘草湯對大鼠胃組織AQP4 蛋白表達的影響（×400）

圖2 茯苓甘草湯對大鼠胃組織Leptin 蛋白表達的影響（×400）

圖3 茯苓甘草湯對大鼠胃組織eNOS 蛋白表達的影響（×400）

表2 茯苓甘草湯對大鼠胃組織AQP4、 Leptin、 eNOS 蛋白表達的影響（±s， n＝5）

表2 茯苓甘草湯對大鼠胃組織AQP4、 Leptin、 eNOS 蛋白表達的影響（±s， n＝5）

注：與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01

組別 劑量／（g·kg-1）AQP4 Leptin eNOS空白組 - 0.59±0.20?? 0.41±0.14? 0.33±0.14?模型組 - 0.32±0.11 0.61±0.13 0.57±0.21茯苓甘草湯組 20 0.57±0.17?? 0.42±0.20? 0.33±0.13?茯苓甘草湯組 10 0.57±0.27? 0.38±0.22? 0.32±0.11??茯苓甘草湯組 5 0.54±0.22? 0.40±0.21? 0.47±0.23多潘立酮組 0.004 0.47±0.17 0.49±0.07 0.41±0.16

3.3 茯苓甘草湯對大鼠胃組織ZO-2、 YAP、 CGRP 蛋白表達的影響 與模型組比較， 茯苓甘草湯各劑量組ZO-2 蛋白表達上調(diào)， 以10 g／kg 組更顯著（P＜0.05）； 各劑量組YAP蛋白表達顯著下調(diào)（P＜0.05， P＜0.01）； 各劑量組CGRP蛋白表達下調(diào)， 以20、 10 g／kg 組更顯著（P＜0.05， P ＜0.01）。 見圖4、 表3 （以光密度表示）。

4 討論

圖4 茯苓甘草湯對大鼠胃組織ZO-2、 YAP、 CGRP蛋白表達的影響

表3 茯苓甘草湯對大鼠胃組織ZO-2、 YAP、 CGRP 蛋白表達的影響（±s， n＝5）

表3 茯苓甘草湯對大鼠胃組織ZO-2、 YAP、 CGRP 蛋白表達的影響（±s， n＝5）

注：與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01

組別 劑量／（g·kg-1）ZO-2／β-actin YAP／β-actin CGRP／β-actin空白組 — 0.22±0.05? 0.29±0.16?? 0.07±0.03?模型組 — 0.09±0.01 0.80±0.05 0.15±0.03茯苓甘草湯組 20 0.22±0.07 0.44±0.17? 0.05±0.02??茯苓甘草湯組 10 0.42±0.10? 0.38±0.17?? 0.07±0.04?茯苓甘草湯組 5 0.32±0.21 0.51±0.19? 0.13±0.08多潘立酮組組 0.004 0.21±0.17 0.62±0.18 0.09±0.06

隨著社會發(fā)展、 生活壓力不斷增加， 功能性消化不良發(fā)病率逐年增加， 其誘因與腦腸軸失衡、 慢性炎癥、 內(nèi)臟感覺異常、 幽門螺旋桿菌感染、 精神相關(guān)因素、 飲食生活失約等有密切聯(lián)系［2-3］。 AQP4 蛋白作為跨膜轉(zhuǎn)運蛋白， 廣泛分布于胃部上皮細胞層內(nèi)， 對胃酸分泌、 水分轉(zhuǎn)運、 滲透壓調(diào)節(jié)起到重要作用［4］； 瘦素（leptin） 分布于胃主細胞和壁細胞內(nèi)， 其分泌受到飲食及神經(jīng)-激素調(diào)節(jié)影響， 可減少食物攝入、 分解脂肪促進機體能量代謝， 并可激活下游JAK、 PI3K 等信號通路參與胰島素分泌調(diào)節(jié)、 炎癥反應(yīng)等病理過程［5］； 內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS） 以L-精氨酸為底物合成NO， 參與血管舒縮調(diào)節(jié)、 抑制血小板凝集、 保護內(nèi)皮細胞等［6］， 在消化系統(tǒng)中可能參與調(diào)節(jié)胃腸黏膜血流、 調(diào)節(jié)胃腸黏膜分泌功能以及保護胃腸黏膜， 目前普遍認為NO 增多會引起胃腸動力減弱； YAP 是Hippo 信號通路的下游蛋白， 有著調(diào)節(jié)器官發(fā)育、 誘發(fā)癌癥、 促進細胞增殖、 雙向調(diào)節(jié)細胞凋亡、 調(diào)節(jié)細胞密度和分布發(fā)生變化等作用［7-8］； ZO-2 是緊密連接蛋白家族成員之一， 存在于細胞緊密連接、 黏附連接和縫隙連接處， 在上皮細胞和內(nèi)皮細胞間起著連接作用， 作為骨架蛋白， 它是胃腸黏膜屏障正常功能發(fā)揮和生理結(jié)構(gòu)完整性的重要保護蛋白， 對維持水分子、 細胞大分子等物質(zhì)進行細胞旁通透有重要意義，其異常表達會造成胃腸黏膜緊密連接功能異常和組織滲透壓失衡， 并可通過攜帶的PDZ 結(jié)構(gòu)域在細胞核與細胞質(zhì)之間自由穿梭， 與YAP 蛋白所攜帶的PDZ 結(jié)合序列相結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)活性， 它既可促進YAP 蛋白進入細胞核激活其活性， 又可將其滯留在細胞質(zhì)中抑制活性的發(fā)揮； 降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP） 是與痛覺調(diào)控相關(guān)的神經(jīng)活性肽， 廣泛存在于胃腸道， 其分泌增高可引起胃黏膜血流量增加、減緩胃腸運動、 痛覺傳導(dǎo)異常敏感， 導(dǎo)致內(nèi)臟高敏感性［9-10］。

本實驗發(fā)現(xiàn)， 茯苓甘草湯具有明顯的促進胃腸運動作用， 與多潘立酮功效相當， 甚至在一定程度上表現(xiàn)更好。給予茯苓甘草湯后， 可改善因稀鹽酸誘導(dǎo)消化不良造成的胃腸蠕動遲緩， 促進腸推進功能； 升高胃黏膜AQP4 蛋白表達， 增強胃內(nèi)水液轉(zhuǎn)運； 降低胃內(nèi)Leptin 高表達， 增強食欲提高胃腸蠕動； 降低胃黏膜eNOS 過表達， 減輕NO 過度生成， 增強胃腸動力； 上調(diào)ZO-2 蛋白表達， 促進組織或細胞間緊密連接； 抑制YAP 蛋白在胃內(nèi)過表達， 減輕黏膜細胞過度增殖； 降低CGRP 蛋白過表達， 增強胃腸蠕動，由此推測， 對這些蛋白的調(diào)節(jié)作用可能是該方改善功能性消化不良的潛在作用機制。