李 志， 冷 羽， 曹 波， 鄧文玲， 董聿錕

（貴陽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院， 貴州 貴陽550001）

肛門直腸瘺簡稱肛瘺， 是指直腸或肛管與周圍皮膚相通的一類常見疾病， 病因大多為肛周膿腫或直腸肛門損傷。 目前其主要治療方式為手術(shù)， 術(shù)后創(chuàng)面為防止繼發(fā)感染需予以暴露直至愈合， 但自然情況下術(shù)后創(chuàng)面愈合緩慢， 病程長， 嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量， 故如何促進(jìn)術(shù)后創(chuàng)面愈合成為臨床工作中面臨的關(guān)鍵問題。 本研究對濕潤生肌膏促進(jìn)肛瘺創(chuàng)面愈合的療效及相關(guān)機(jī)制進(jìn)行探索， 以期為該制劑的臨床應(yīng)用提供依據(jù)， 現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 對象、 分組、 一般資料、 臨床診斷標(biāo)準(zhǔn) 研究對象為2014 年6 月至2016 年12 月于貴陽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院肛腸科收治的90 例單純性肛瘺術(shù)后患者， 隨機(jī)數(shù)字表法分為3 組， 其中術(shù)后使用濕潤生肌膏治療的30 例患者作為觀察組， 使用龍珠軟膏治療的30 例患者作為對照組， 使用凡士林紗條治療的30 例患者作為凡士林組， 3 組性別、年齡、 體質(zhì)量、 創(chuàng)面平均縱經(jīng)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）， 具有可比性， 見表1。 臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)參照美國結(jié)直腸外科醫(yī)師協(xié)會于2011 年推出的美國肛周膿腫和肛瘺治療指南［1］， 即內(nèi)口在肛隱窩，僅有1 個(gè)瘺道通過外括約肌皮下部或淺部， 與皮膚相通； 所有創(chuàng)面縱徑在2.5～3.0 cm 之間、 術(shù)后傷口深度達(dá)外括約肌淺部的低位單純性肛瘺。 患者及家屬均自愿同意參與本研究， 并簽署知情同意書。

表1 3 組患者一般資料比較（±s， n＝30）Tab.1 Comparison of general data among the three groups （±s， n＝30）

表1 3 組患者一般資料比較（±s， n＝30）Tab.1 Comparison of general data among the three groups （±s， n＝30）

組別 性別比［（男／女）／例］ 年齡／歲 體質(zhì)量／kg 創(chuàng)面平均縱經(jīng)／cm觀察組 6.5（26／4）38.01±5.17 58.9±12.8 2.81±0.19對照組 9（27／3）37.68±4.38 57.6±15.8 2.78±0.27凡士林組 6.5（26／4）37.85±5.05 58.4±14.3 2.74±0.25

1.2 材料 Leica RM2235 切片機(jī)（德國Leica 公司）； Olympus DSX100 光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）； NanoDrop 2000 超微量分光光度計(jì)（美國NanoDrop 公司）； Applied Biosystems 9700 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀 （美國Applied Biosystems 公司）；Eppendorf 5424R 高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf公司）。 RNA 提取試劑Trizol、 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green 核酸熒光染料（日本TaKaRa 公司）；蘇木素-伊紅試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）； 龍珠軟膏（馬應(yīng)龍藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司）。甲醛、 甲醇、 異丙醇、 無水乙醇等（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法

2.1 濕潤生肌膏制備 組方黃芩、 黃柏、 甘草、白芨、 紫草、 冰片（湖北西銀和生物科技有限公司， 25 kg／桶， 批號20140409）、 硼砂（湖北西銀和生物科技有限公司， 25 kg／袋， 批號20140328）、川芎、 壁虎粉。 將黃芩、 黃柏、 甘草、 白芨、 川芎、 壁虎粉洗凈后， 105 ℃下干燥4 h， 與紫草一起粉碎， 過120 目篩， 加入冰片和硼砂， 研勻， 加入乳膏基質(zhì)（硬脂酸、 單硬脂酸甘油酯、 液狀石蠟、 白凡士林、 羊毛脂作為油相， 三乙醇胺、 蒸餾水作為水相， 分別于水浴上加熱至80 ℃左右。 等溫下將水相緩慢倒入油相中， 水浴上不斷攪拌至呈乳白色半固體狀， 再在室溫下攪拌至近冷凝）， 研勻， 即得。

2.2 創(chuàng)面處理及術(shù)后給藥 術(shù)前均備皮、 清潔灌腸， 連續(xù)硬膜外麻醉。 患者均行瘺切除術(shù)， 修剪創(chuàng)緣， 使切口呈下窄上寬的“V” 字型， 以便引流通暢， 切口均不縫合， 創(chuàng)面縱徑2.5 ～3.0 cm。 換藥前均常規(guī)消毒， 每天1 次至創(chuàng)面愈合（術(shù)后均使用同種抗生素5 d、 止血藥3 d、 止痛藥3 d）。

2.3 標(biāo)本收集 術(shù)后第7 天換藥時(shí)， 組織剪剪下2.0 mm×2.0 mm 新鮮肉芽組織， 取30 mg 左右置于凍存管中液氮保存， 剩余組織放入事先準(zhǔn)備好的10%福爾馬林溶液試劑瓶中， 作好編號， 送至病理實(shí)驗(yàn)室。

2.4 肉芽組織VEGF、 bFGF mRNA 表達(dá)檢測 采用RT-PCR 法。 液氮中取出30 mg 肉芽組織， 無菌條件下剪碎并研磨， 加入1 mL RNAiso Reagent 試劑， 冰上裂解5 min 后吸取上清液， 加入1.5 mL離心管中， 嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行提取， 將所得RNA 沉淀于室溫下干燥10 min， 50 μL 無核酶水稀釋沉淀并混勻， 37 ℃下促溶5 min， 超微量分光光度計(jì)檢測RNA 濃度。 取1 μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄， 嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作， 得到20 μL PCR cDNA產(chǎn)物后， 無核酶水稀釋至500 μL， RT-qPCR 體系配置10 μL SYBR Green 核酸熒光染料， 加入5 μL（10 ng） 模板cDNA 及5 μL 引物， 每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行孔， 置于PCR 儀中進(jìn)行定量分析。 循環(huán)參數(shù)為預(yù)變性94 ℃4 min； 擴(kuò)增條件為94 ℃30 s，60 ℃1 min， 共40 個(gè)循環(huán)； 血管內(nèi)皮生長因子（VEGF） 正向引物GGGCGCGCCGCGGAGGGGGTGCTGG， 反向引物AGACCCTGGTTGCCAGGTCATGCGG， 擴(kuò)增引物249 bp； 堿性成纖維細(xì)胞生長因子 （bFGF） 正 向 引 物 GGAGCCCAGGGAATGCCAAAGCCCT， 反 向 引 物GCAGGTGGAAAGATCTGATCTTGGA， 擴(kuò)增引物211 bp。 以β-actin 為內(nèi)參基因， 其正向引物序列 TGGCACCCAGCAC AATGAA， 反向引物序列CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA， 目的片段186 bp； 以VEGF、 bFGF表達(dá)量與內(nèi)參基因表達(dá)量的比值作為其mRNA 相對表達(dá)量。

2.5 肉芽組織毛細(xì)血管數(shù)檢測［2］采用蘇木素-伊紅染色。 取出10%福爾馬林溶液固定好的肉芽組織， 二級水沖洗后自然晾干， 進(jìn)行石蠟包埋， 于50%、 70%、 80%、 90%、 95% 乙醇及無水乙醇中各處理40 min， 無水乙醇與二甲苯混合液（比例1 ∶1） 處理1 h， 二甲苯處理30 min， 二甲苯與軟蠟（比例1 ∶1） 處理1 h， 軟蠟、 硬蠟分別處理1 h， 切片機(jī)制成4 μm 切片， 之后嚴(yán)格按蘇木素-伊紅試劑盒說明書進(jìn)行染色。 蘇木素染色切片在光學(xué)顯微鏡下觀察， 每張切片取5 個(gè)視野， 計(jì)算每個(gè)視野內(nèi)具有完整管腔的毛細(xì)血管數(shù)（×200）。

2.6 創(chuàng)面愈合時(shí)間測定 即創(chuàng)面完全上皮化所需時(shí)間， 上皮化依靠肉眼觀察［3］。 每天換藥觀察創(chuàng)面愈合程度， 如創(chuàng)面被新生肉芽組織填滿， 覆蓋組織完全上皮化， 即確定為創(chuàng)面愈合時(shí)間。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 17.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（±s） 表示， 方差分析比較計(jì)量資料間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異， SNK 法進(jìn)行多組資料間的兩兩比較， χ2檢驗(yàn)比較計(jì)數(shù)資料間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異， 檢驗(yàn)水準(zhǔn)α ＝0.05。 以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 VEGF、 bFGF mRNA 表達(dá) 觀察組術(shù)后第7天VEGF mRNA 相對表達(dá)量為0.763±0.082， 顯著高于對照組的0.401±0.043、 凡士林組的0.315±0.032 （P＜0.05）。 觀察組術(shù)后第7 天bFGF mRNA相對表達(dá)量為1.370±0.127， 顯著高于對照組的1.049±0.062、 凡士林組的0.597±0.084 （P ＜0.05）。 見圖1。

圖1 3 組VEGF、 bFGF mRNA 表達(dá)比較Fig.1 Comparison of VEGF and bFGF mRNA expressions among the three groups

3.2 毛細(xì)血管數(shù) 觀察組術(shù)后第7 天創(chuàng)面肉芽組織鏡下， 每個(gè)視野的毛細(xì)血管數(shù)為（30.06±5.25）個(gè)， 顯著多于對照組的（24.80±4.58） 個(gè)、 凡士林組的（15.30±3.07） 個(gè)（P＜0.05）。 見圖2。

3.3 創(chuàng)面愈合時(shí)間 觀察組創(chuàng)面愈合時(shí)間為（17.03±3.35） d， 顯著短于對照組的 （18.87±2.72） d、 凡 士林 組 的 （22.13 ± 3.63） d （P ＜0.05）。

4 討論

肛瘺是一種臨床常見病， 主要表現(xiàn)為肛周流膿， 伴疼痛、 瘙癢或排便不暢， 大多數(shù)患者不能自愈， 需要手術(shù)治療， 但由于手術(shù)創(chuàng)口所在肛周活動性大、 極易污染， 術(shù)后創(chuàng)面不可縫合， 自然愈合過程相當(dāng)緩慢， 導(dǎo)致患者病程較長， 嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。 中醫(yī)認(rèn)為， 肛瘺術(shù)后創(chuàng)面濕熱未盡， 毒熱內(nèi)聚， 并由于經(jīng)絡(luò)損傷、 氣血不暢， 致創(chuàng)面失于榮養(yǎng)， 愈合遲緩； 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)指出， 重組人表皮生長因子可有效促進(jìn)創(chuàng)面愈合［4-5］， 但目前大多應(yīng)用于燒傷， 對肛瘺術(shù)后創(chuàng)面的愈合療效尚不確切。

圖2 3 組毛細(xì)血管數(shù)比較（×200）Fig.2 Comparison of blood capillary counts among the three groups （×200）

目前， 多種中成藥能通過促進(jìn)創(chuàng)面組織上皮細(xì)胞表皮生長因子的釋放、 上皮細(xì)胞的增殖、 外基質(zhì)的合成， 進(jìn)而加速創(chuàng)面愈合［6-8］。 課題組前期研究［6］發(fā)現(xiàn)， 濕潤生肌膏較龍珠軟膏、 凡士林紗條能更有效緩解患者疼痛， 并可加速患者術(shù)后創(chuàng)面愈合， 但相關(guān)機(jī)制及途徑尚不完全清楚。 創(chuàng)面修復(fù)涉及多種細(xì)胞因子參與、 成纖維細(xì)胞增殖、 新生血管形成等多個(gè)環(huán)節(jié)［9］， 其中VEGF 是由2 個(gè)分子量17～22 kD 亞基形成的二聚體， 在代謝旺盛、 供血豐富的組織中有著高表達(dá)， 是內(nèi)皮細(xì)胞特異的有絲分裂原［10-11］， 具有強(qiáng)大的促血管生成作用， 并對血管內(nèi)皮細(xì)胞有特殊的專一性［12］， 其表達(dá)增加可有效促進(jìn)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、 新生血管生成［13］、 血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和管腔形成， 整合血管內(nèi)皮細(xì)胞功能結(jié)構(gòu)協(xié)調(diào)同步發(fā)展［14］； bFGF 與VEGF 一樣， 作為內(nèi)皮細(xì)胞特異的有絲分裂原也具有廣泛的促細(xì)胞增殖效應(yīng)［15-16］， 可促進(jìn)細(xì)胞分化，通過調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞遷移、 纖溶酶原產(chǎn)生來調(diào)控機(jī)體內(nèi)血管新生的整個(gè)過程［17-18］。 研究結(jié)果顯示， 觀察組術(shù)后用藥第7 天創(chuàng)面肉芽組織中VEGF、 bFGF mRNA 表達(dá)均顯著高于對照組和凡士林組， 表明濕潤生肌膏能有效上調(diào)兩者表達(dá)， 也在分子層面上體現(xiàn)了該制劑優(yōu)勢， 其機(jī)制可能與所含黃芩、 黃柏等藥材對血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用有關(guān)［19-21］。 然后，觀察了各組術(shù)后第7 天創(chuàng)面肉芽組織中毛細(xì)血管數(shù)， 發(fā)現(xiàn)觀察組顯著多于其他2 組， 進(jìn)一步說明VEGF、 bFGF 存在協(xié)同作用， 可共同促進(jìn)創(chuàng)面肉芽組織新生毛細(xì)血管形成， 而濕潤生肌膏可促進(jìn)兩者表達(dá)上調(diào)， 相比龍珠軟膏有著更顯著的療效。 同時(shí)， 觀察組創(chuàng)面愈合時(shí)間顯著短于其他2 組， 也印證了濕潤生肌膏對肛瘺創(chuàng)面愈合的確切療效。

綜上所述， 濕潤生肌膏可通過上調(diào)VEGF、bFGF mRNA 表達(dá)， 促進(jìn)肛瘺術(shù)后患者肉芽組織中毛細(xì)血管生成， 進(jìn)而加快創(chuàng)面愈合， 提高生活質(zhì)量， 有利于預(yù)后， 是值得臨床推廣的治療方式。