胡 輝， 劉源才， 龔華夢(mèng)

（1. 勁牌生物醫(yī)藥有限公司， 湖北 黃石435100； 2. 勁牌研究院， 湖北 黃石435100； 3. 中藥保健食品質(zhì)量與安全湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 湖北 大冶435100）

北豆根系防已科植物蝙蝠葛Menispermum dauricum DC. 的干燥根莖， 始載于《中國(guó)藥用植物志》， 原名蝙蝠葛根［1］， 主產(chǎn)于東北、 華北、 陜西等地， 具有清熱解毒、 祛風(fēng)止痛的功效， 常用于咽喉腫痛、 熱毒瀉痢、 風(fēng)濕痹痛等［2］， 現(xiàn)代藥理研究表明其具有良好的抗炎［3］、 抑菌［4］、 抗心律失常［5］、 抗高血壓［6］、 抗腫瘤［7］作用， 其中生物堿類成分蝙蝠葛蘇林堿和蝙蝠葛堿是其主要的有效成分［8］。 隨著中藥現(xiàn)代化發(fā)展， 近幾年來(lái)對(duì)北豆根制劑的研究比較深入， 在北豆根片、 膠囊之后， 又開發(fā)出了北豆根分散片、 咀嚼片、 口腔崩解片、 軟膠囊、 氣霧劑、 粉針劑、 滴丸、 緩控制劑， 臨床上主要用于口腔及咽部的炎癥治療［9］， 但尚無(wú)用于中醫(yī)辨證論治的北豆根配方顆粒報(bào)道。

北豆根配方顆粒作為中藥現(xiàn)代劑型， 配方后使用時(shí)只需加水沖服即可， 因此相較于傳統(tǒng)湯劑具有便捷、 高效、 易貯存等特點(diǎn)， 并且該制劑以《中國(guó)藥典》 規(guī)定的北豆根飲片為原料， 通過(guò)水煎煮、過(guò)濾、 濃縮、 干燥、 制粒等流程制成， 其性味歸經(jīng)、 功能主治與原藥材相同， 規(guī)范其質(zhì)量對(duì)臨床應(yīng)用具有十分重要的意義［10］。 因此， 本實(shí)驗(yàn)以2015版《中國(guó)藥典》 中北豆根項(xiàng)下相關(guān)內(nèi)容為參考，建立北豆根配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)， 為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Thermo Fisher UltiMate 3000 系列高效液相色譜儀 （配置LPG-3400SDN 四元梯度泵、WPS-3000SL 自動(dòng)進(jìn)樣器、 TCC-3000RS 柱溫箱、VWD-3100 檢 測(cè) 器、 DAD-3000 檢 測(cè) 器）；Quintix125D-1CN 電子天平 （十萬(wàn)分之一， 德國(guó)Sartorius 公司）； PURELAB Classic 純水機(jī) （英國(guó)ELGA 公司）。

1.2 試藥 蝙蝠葛蘇林堿對(duì)照品（含有量98%，批號(hào)AP154D， 天津一方科技有限公司）； 蝙蝠葛堿對(duì)照品（含有量98.5%， 批號(hào)111867-201503）、北豆根對(duì)照藥材（批號(hào)120977-201404） （中國(guó)食品藥品檢定研究院）。 硅膠G 薄層板（青島海洋化工廠分廠）。 乙腈（批號(hào)172009， 美國(guó)Fisher 公司）、 三乙胺（批號(hào)P1238512， 上海阿達(dá)瑪斯試劑有限公司） 為色譜純； 其他試劑均為分析純； 水為超純水。 北豆根飲片（湖北正光九資河藥業(yè)有限公司， 批號(hào)160801）， 經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所郭寶林教授鑒定為防已科植物蝙蝠葛Menispermum dauricum DC. 的干燥根莖。 北豆根配方顆 粒 （ 勁 牌 生 物 醫(yī) 藥 有 限 公 司， 批 號(hào)P20170225、 P20170226、 P20170227、 P20170229、P20170301、 P20170302、 P20170304、 P20170305、P20170307、 P20170309， 1 g／袋， 相 當(dāng) 于 飲 片7.1 g）。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC 定性鑒別 取配方顆粒 （批號(hào)P20170225、 P20170226、 P20170227） 適 量， 研細(xì)， 取0.5 g， 加 乙 酸 乙 酯15 mL、 濃 氨 試 液0.5 mL， 加熱回流30 min， 濾過(guò)， 濾液蒸干， 殘?jiān)? mL 乙酸乙酯溶解， 作為供試品溶液； 另取對(duì)照藥材0.5 g， 同法制成相應(yīng)溶液。 按照2015 版《中國(guó)藥典》 一部通則0502， 吸取上述2 種溶液各2 μL， 點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上， 以三氯甲烷-甲醇-濃氨試液（9 ∶1 ∶1） 為展開劑， 展開， 取出，晾干， 置于紫外光燈（365 nm） 下檢視， 結(jié)果見圖1。 由圖可知， 供試品色譜在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色熒光斑點(diǎn)， 表明該方法簡(jiǎn)便靈敏， 專屬性強(qiáng)， 可用于TLC 定性鑒別。

2.2 醇浸出物含有量測(cè)定 取各批次配方顆粒，研細(xì)， 過(guò)4 號(hào)篩［孔徑（250±9.9） μm］， 取2 ～4 g， 按2015 版《中國(guó)藥典》 醇溶性浸出物測(cè)定法項(xiàng)下熱浸法測(cè)定， 以乙醇為溶劑。結(jié)果， 醇浸出物含有量在38.75% ～45.36% 之間， 平均42.70%，RSD 5.43%， 表明配方顆粒穩(wěn)定性良好。

圖1 樣品TLC 色譜圖Fig.1 TLC chromatogram of samples

2.3 指紋圖譜建立

2.3.1 色譜條件 Waters T3 C18色譜柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）， 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑； 流動(dòng)相乙腈（A） -0.05%三乙胺（B）， 梯度洗脫， 程序見表1； 檢測(cè)波長(zhǎng)290 nm； 進(jìn)樣量10 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

2.3.2 溶液制備

2.3.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取蝙蝠葛蘇林堿、蝙蝠葛堿對(duì)照品適量， 置于棕色量瓶中， 加甲醇制成每1 mL 分別含兩者0.2、 0.3 mg 的溶液， 搖勻，即得。

2.3.2.2 供試品溶液 精密稱取本品粉末約0.1 g， 20%甲醇定容至10 mL， 超聲30 min 后混勻， 0.22 μm 針頭過(guò)濾器過(guò)濾， 即得。

2.3.3 專屬性試驗(yàn) 取對(duì)照品、 供試品溶液， 在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定， 結(jié)果見圖2。 由圖可知， 2 種溶液在相同保留時(shí)間上都有色譜峰，表明該方法專屬性良好。

圖2 各成分HPLC 色譜圖（Ⅰ）Fig.2 HPLC chromatograms of various constituents （Ⅰ）

2.3.4 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液， 在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次， 測(cè)得指紋圖譜相似度均大于0.872， 表明儀器精密度良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液， 于1、3、 5、 11、 17、 23 h 在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定， 測(cè)得指紋圖譜相似度均大于0.923， 表明溶液在23 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)配方顆粒， 按“2.3.2.2” 項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液， 在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定， 測(cè)得指紋圖譜相似度均大于0.978， 表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.7 建立方法 按“2.3.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定， 指紋圖譜見圖3， 再將其導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件（2012.130723 版本）， 測(cè)得10 批配方顆粒的相似度均在0.927 以上， 顯示出良好的穩(wěn)定性和特征性。

圖3 10 批樣品HPLC 指紋圖譜Fig.3 HPLC fingerprints of ten batches of samples

2.4 含有量測(cè)定

2.4.1 色譜條件 Waters T3 C18色譜柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）， 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑； 流 動(dòng) 相 乙 腈-0.05% 三 乙 胺， 等 度 洗 脫（45 ∶55）； 檢測(cè)波長(zhǎng)284 nm； 柱溫20 ℃； 進(jìn)樣量10 μL。 理論塔板數(shù)按蝙蝠葛堿峰計(jì)算， 應(yīng)不低于6 000。

2.4.2 溶液制備

2.4.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取蝙蝠葛蘇林堿、蝙蝠葛堿對(duì)照品適量， 置于棕色量瓶中， 加甲醇制成每1 mL 分別含兩者0.2、 0.3 mg 的溶液， 搖勻，即得。

2.4.2.2 供試品溶液 精密稱取本品粉末約0.1 g， 20% 甲醇超聲30 min， 定容至10 mL， 混勻， 0.22 μm 針頭過(guò)濾器過(guò)濾， 即得。

2.4.3 專屬性試驗(yàn) 取對(duì)照品、 供試品溶液， 在“2.4.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定， 結(jié)果見圖4。 由圖可知， 2 種溶液在相同保留時(shí)間上都有色譜峰，表明該方法專屬性良好。

圖4 各成分HPLC 色譜圖（Ⅱ）Fig.4 HPLC chromatograms of various constituents （Ⅱ）

2.4.4 線性關(guān)系考察 分別精密稱取蝙蝠葛蘇林堿、 蝙蝠葛堿對(duì)照品5.4、 8.8 mg， 甲醇溶解并定容至25 mL， 搖勻， 得211.68、 346.72 mg／L 貯備液， 各取5 mL 置 于 同 一10 mL 量 瓶 中， 得105.84、 173.36 mg／L 溶液， 依次稀釋2 倍， 制得含13.23、 26.46、 52.92、 105.84、 211.68 mg／L蝙 蝠 葛 蘇 林 堿， 以 及 21.67、 43.34、 86.68、173.36、 346.72 mg／L 蝙蝠葛堿的溶液， 命名為DZ-1、 DZ-2、 DZ-3、 DZ-4、 DZ-5， 各取10 μL， 在“2.4.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。 以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）， 峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸， 得方程分別為蝙蝠葛蘇林堿Y ＝0.111 58X-0.157 42（R2＝0.999 85）、 蝙蝠葛堿Y ＝0.158 94X-0.613 92（R2＝0.999 16）， 分別在13.23 ～211.68、 21.67 ～346.72 mg／L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批配方顆粒（批號(hào)P20170225）， 按“2.4.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液6 份， 在“2.4.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得蝙蝠葛蘇林堿、 蝙蝠葛堿含有量RSD 分別為2.78%、 2.33%， 表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.6 精密度試驗(yàn) 取“2.4.4” 項(xiàng)下DZ-5 溶液， 在“2.4.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次， 測(cè)得蝙蝠葛蘇林堿、 蝙蝠葛堿峰面積RSD 分別為0.74%、 0.25%， 表明儀器精密度良好。

2.4.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.4.4” 項(xiàng)下DZ-5 溶液， 于6、 8、 12、 20、 30、 32 h 在“2.4.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定， 測(cè)得蝙蝠葛蘇林堿、 蝙蝠葛堿峰面積RSD 分別為2.62%、 0.53%， 表明溶液在32 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取含有量已知的同一批配方顆粒（批號(hào)P20170225， 蝙蝠葛蘇林堿、 蝙蝠葛堿含有量分別為0.595 0%、 2.608 7%）9 份， 精密加入各對(duì)照品溶液適量， 按“2.4.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 在“2.4.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定， 結(jié)果見表2。

表2 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents （n＝9）

2.4.9 樣品含有量測(cè)定 取10 批配方顆粒， 按“2.4.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 各精密吸取10 μL， 在“2.4.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含有量， 結(jié)果見表3。

3 討論

北豆根成分復(fù)雜， 除了含有大量生物堿外， 還含有揮發(fā)性成分、 多糖、 醌類、 強(qiáng)心苷、 內(nèi)酯、 皂苷、 鞣質(zhì)、 蛋白質(zhì)、 樹脂等成分［11］， 將其制成配方顆粒時(shí)， 不僅可保留原藥材性味、 主要有效成分、 功效作用， 還能提高用藥便捷性和藥方調(diào)配靈活性。 本實(shí)驗(yàn)測(cè)得10 批配方顆粒中醇浸出物平均含有量為42.70%， 按測(cè)定結(jié)果平均值的80% 計(jì)算， 暫定其含有量不得低于34.16%。

與傳統(tǒng)藥材飲片相比， 配方顆粒失去了外觀性狀特征， 指紋圖譜相當(dāng)于為其貼上了“化學(xué)條形碼”［12］， 使其有了獨(dú)有質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， 10 批配方顆粒指紋圖譜相似度較高， 并具有良好的穩(wěn)定性和特征性， 暫定其相似度不得低于90%。

由于蝙蝠葛蘇林堿、 蝙蝠葛堿是北豆根主要有效成分， 故本實(shí)驗(yàn)建立HPLC 法測(cè)定兩者含有量。結(jié)果， 兩者總含有量平均值為3.160 5%， 按測(cè)定結(jié)果平均值的80%計(jì)算， 暫定其總含有量不得低于2.528 4%。

表3 各成分含有量測(cè)定結(jié)果Tab.3 Results of content determination of various constituents

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了北豆根配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)， 發(fā)現(xiàn)TLC 法簡(jiǎn)便靈敏， 專屬性強(qiáng)； 醇浸出物含有量限度設(shè)置合理； HPLC 指紋圖譜精密度、 穩(wěn)定性、 重復(fù)性良好； 主要有效成分蝙蝠葛蘇林堿、 蝙蝠葛堿含有量測(cè)定方法簡(jiǎn)便準(zhǔn)確， 專屬性強(qiáng)， 含有量限度設(shè)置合理， 可用于該制劑的質(zhì)量控制。