程 棟， 申蘭慧， 金 堅(jiān)， 楊敏智?

（1. 江南大學(xué)藥學(xué)院， 江蘇 無(wú)錫214122； 2. 無(wú)錫市藥品安全檢驗(yàn)檢測(cè)中心， 江蘇 無(wú)錫214028）

丹參川芎嗪注射液由丹參、 鹽酸川芎嗪、 甘油、 注射用水組成， 制備方法為丹參水提后經(jīng)過(guò)石硫法處理， 醇沉， 再添加鹽酸川芎嗪和輔料制成［1］， 具有抗血小板聚集、 擴(kuò)張外周血管、 改善微循環(huán)等作用， 適用于閉塞性腦血管疾病、 缺血性心血管疾病， 如急性腦梗死、 慢性腦供血不足、 缺血性心腦病等， 但其臨床應(yīng)用較廣泛的同時(shí)也存在不良反應(yīng)［2-4］。 目前。 丹參川芎嗪注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中只對(duì)丹參素進(jìn)行含有量限定， 但中藥注射液成分復(fù)雜， 其他物質(zhì)也可能對(duì)疾病治療起著重要作用［5-6］。 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-Q-TOF-MS／MS） 同時(shí)測(cè)定丹參川芎嗪注射液中丹參素、 原兒茶醛、 咖啡酸、迷迭香酸、 丹酚酸B 的含有量， 并結(jié)合相應(yīng)對(duì)照品推導(dǎo)各成分二級(jí)質(zhì)譜裂解途徑［7-12］， 為該制劑質(zhì)量控制提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1290 UPLC-6530AQ-TOF MS儀， 配置MassHunter 工作站等 （美國(guó)Agilent 公司）； XSE205 電子天平 （瑞士Mettler-Toledo 公司）； S100H 超聲儀（德國(guó)Elmasonic 公司）； Millipore 純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore 公司）。

1.2 試藥 丹參素鈉（批號(hào)110855-201613）、 咖啡酸 （批號(hào)11885-200102）、 原兒茶醛 （批號(hào)110810-201608）、 迷 迭 香 酸 （ 批 號(hào) 111871-201505）、 丹酚酸B （批號(hào)111562-201615） 對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。 丹參川芎嗪注射液（貴州某公司生產(chǎn)， 批號(hào)20160436、 20161008、20161012、 20170219、 20170220， 5 mL／支， 其 中批號(hào)20160436 作為方法學(xué)驗(yàn)證樣品）。 甲醇為色譜純（德國(guó)默克公司）； 甲酸為分析純（美國(guó)Acros公司）； 超純水由Milli-Q 儀器制備。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 ZORBAX Eclipse Plus-C18色譜柱（2.1 mm×50 mm， 1.8 μm）； 流動(dòng)相乙腈（A） -0.5%甲酸（B）， 梯度洗脫（0 ～5 min， 5% ～8%A； 5～12 min， 8% ～40% A； 12 ～13 min， 40% ～80%A； 13～15 min， 80%A； 15 ～15.1 min， 80% ～5%A； 15.1～17 min， 5%A）； 柱溫35 ℃； 體積流量0.3 mL／min； 進(jìn)樣量1 μL。

2.2 質(zhì)譜條件 ESI 負(fù)離子檢測(cè)方式； 干燥氣溫度350 ℃， 體 積 流 量10 L／min； 毛 細(xì) 管 電 壓3.5 kV； 霧化氣壓力45 psi （1 psi ＝6.895 kPa）；碎裂電壓105 V； 錐孔電壓75 V； OCT 1RF Vpp 750 V； 洗針時(shí)間3 s； 掃描速率2 spectra／s， 體積流量0.3 mL／min； 掃描方式MS、 MS／MS 全掃描，掃描范圍m／z 50～1 000。

2.3 溶液制備

2.3.1 對(duì)照品溶液 分別精密稱(chēng)取對(duì)照品丹參素鈉11.61 mg、 丹酚酸B 11.95 mg、 迷迭香酸11.64 mg、原兒茶醛10.38 mg、 咖啡酸10.31 mg， 置于50 mL量瓶中， 甲醇超聲15 min， 放冷至室溫， 甲醇稀釋至刻度， 制得貯備液， 分別精密量取3、 0.5、 1、0.05、 0.4 mL 于10 mL 量瓶中， 甲醇定容， 即得。2.3.2 供試品溶液 精密量取本品1 mL， 置于5 mL量瓶中， 甲醇稀釋至刻度， 搖勻， 0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾， 即得。

2.4 質(zhì)譜分析 見(jiàn)表1、 圖1～2。

2.5 線(xiàn)性方程考察 精密量取“2.3.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液3 mL， 置于15 mL 量瓶中， 甲醇稀釋至刻度， 在“2.1” ～ “2.2” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣1、 3、5、 7、 9、 10 μL 測(cè)定。 以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X） 進(jìn)行回歸， 結(jié)果見(jiàn)表2， 可知各成分在各自范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

表1 各成分MS 參數(shù)Tab.1 MS parameters for various constituents

圖1 各成分總離子流色譜圖Fig.1 Total ion current chromatograms of various constituents

圖2 各成分二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.2 MS2 spectra of various constituents

表2 各成分線(xiàn)性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.6 定量限、 檢出限考察 取“2.3.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液， 逐級(jí)稀釋后在“2.1” ～ “2.2” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定， 測(cè)得丹參素、 原兒茶醛、 咖啡酸、迷迭香酸、 丹酚酸B 檢出限 （S／N ＝3） 分別為0.027、 0.012、 0.011、 0.018、 0.013 μg／mL， 定量限（S／N ＝10） 分別為0.081、 0.036、 0.033、0.054 、 0.039 μg／mL。

2.7 精密度試驗(yàn) 取“2.3.1” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液，在“2.1” ～ “2.2” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次， 測(cè)得丹參素、 原兒茶醛、 咖啡酸、 迷迭香酸、 丹酚酸B 峰 面 積 RSD 分 別 為 1.9%、 0.6%、 2.2%、1.1%、 1.7%， 表明儀器精密度較好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品6 份（批號(hào)20160436），按 “2.3.2” 項(xiàng) 下 方 法 制 備 供 試 品 溶 液， 在“2.1” ～ “2.2” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定， 測(cè)得丹參素、 原兒茶醛、 咖啡酸、 迷迭香酸、 丹酚酸B 峰面 積 RSD 分 別 0.2%、 1.6%、 1.3%、 0.3%、0.4%， 表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批本品 （批號(hào)20160436）， 按“2.3.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 于0、 2、 4、 6、 8、 12 h 在“2.1” ～ “2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定， 測(cè)得丹參素、 原兒茶醛、 咖啡酸、 迷迭香酸、 丹酚酸B 含有量RSD 分別為1.4%、 1.9%、 2.6%、 1.7%、 1.6%， 表明溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取本品 （批號(hào)20160436） 0.5 mL， 置于5 mL 棕色量瓶中， 平行6 份， 按1 ∶1 比例加入適量對(duì)照品， 甲醇稀釋至刻度， 搖勻， 在“2.1” ～ “2.2” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定， 計(jì)算回收率， 結(jié)果見(jiàn)表3。

2.11 樣品含有量測(cè)定 取本品6 批， 按“2.3.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液， 在“2.1” ～“2.2” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定， 平行3 份， 計(jì)算含有量， 結(jié)果見(jiàn)表4。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)考察了乙腈-10 mmol／L 乙酸銨 （含0.1%甲酸）、 甲醇-0.5% 甲酸、 乙腈-0.1% 甲酸、乙腈-0.5%甲酸， 發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.5% 甲酸為流動(dòng)相時(shí)分離效果明顯。 乙腈洗脫效果比甲醇強(qiáng)， 可使中藥注射液成分得到很好地分離， 而且在流動(dòng)相中加入適當(dāng)比例甲酸有利于改善成分準(zhǔn)分子離子峰峰型， 使其更加尖銳對(duì)稱(chēng)， 同時(shí)基線(xiàn)也相對(duì)平穩(wěn)。

在咖啡酸提取離子流圖中， 該成分在4.02 min出現(xiàn)離子峰， 同時(shí)在1.58 min 也出現(xiàn)該類(lèi)型峰。丹參素脫去1 個(gè)H2O 后形成雙鍵， 從而變?yōu)榭Х人幔?兩者相對(duì)分子質(zhì)量剛好相差18， 其原因可能為樣品經(jīng)色譜柱液相分離時(shí)咖啡酸、 丹參素未發(fā)生變化， 而進(jìn)入ESI 高溫、 高壓離子源時(shí)后者部分發(fā)生結(jié)構(gòu)變化， 脫去1 個(gè)水分子而形成前者。

從樣品總離子流色譜圖中發(fā)現(xiàn)， 還有多種其他成分存在， 而且原兒茶醛、 丹酚酸B、 咖啡酸、 迷迭香酸具有提高受損細(xì)胞活力、 抑制動(dòng)脈粥樣硬化形成、 增強(qiáng)凝血和抗凝血雙向調(diào)節(jié)、 抗心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷等作用， 有助于臨床治療。 因此， 本實(shí)驗(yàn)建立UPLC-Q-TOF-MS／MS 法同時(shí)測(cè)定丹參川芎嗪注射液中丹參素、 原兒茶醛、 咖啡酸、 迷迭香酸、 丹酚酸B 的含有量， 有利于提高該制劑臨床安全性， 也可為其質(zhì)量控制提供參考。

表3 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

表4 各成分含有量測(cè)定結(jié)果（mg／mL， n＝3）Tab.4 Results of content determination of various constituents （mg／mL， n＝3）