楊 林， 徐曉珍， 陳勁柏， 吳友蘋， 陳嬌婷， 辛艷飛

（1. 浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院安全性評價(jià)研究中心， 浙江 杭州310013； 2. 浙江工業(yè)大學(xué)長三角綠色制藥協(xié)同創(chuàng)新中心， 浙江 杭州310013； 3. 紹興市中醫(yī)院， 浙江 紹興312499； 4. 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院，浙江 杭州310006）

參麥注射液是由古方參麥飲衍變而來， 由紅參、 麥冬提煉精制而成， 為臨床常用中藥注射液之一［1-2］， 在益氣固脫、 養(yǎng)陰生津的傳統(tǒng)藥效基礎(chǔ)上， 它還具有抗心肌缺血、 去除氧自由基等藥理作用， 臨床上廣泛應(yīng)用于治療心血管疾病、 免疫功能低下、 各種慢性疾?。?-5］。

研究表明， 人參皂苷是參麥注射液中最主要的有效成分， 但現(xiàn)行檢測標(biāo)準(zhǔn)僅采用HPLC 法對人參皂苷Rg1、 Re、 Rb1 含有量進(jìn)行測定， 難以全面控制制劑質(zhì)量［6］； 目前也有采用HPLC 法同時測定其中多種人參皂苷含有量的報(bào)道［7-8］， 但受限于方法分離度和靈敏度問題， 分析時間較長， 分離效果也不理想。 本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜（UHPLC）法同時測定參麥注射液中人參皂苷Rg1、 Re、 Rf、Rb1、 Rc、 Rb2、 Rd、 Rg3 的含有量， 以期為全面評價(jià)該制劑質(zhì)量提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1290 infinity 超高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）； MS105DU 型電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海） 有限公司］。

1.2 試藥 人參皂苷Rg1（批號Z26S7X21730， 含有量98%）、 人參皂苷Re （批號B10M8S35243，含有量98%）、 人參皂苷Rf （批號P09M8F31017，含有量98%）、 人參皂苷Rb1（批號Z06M8L30693，含有量98%）、 人參皂苷Rc （批號P24F8F30057，含 有 量 98%）、 人 參 皂 苷 Rb2 （ 批 號P09M8F35575， 含有量98%）、 人參皂苷Rd （批號Z27F8X30060， 含有量98%）、 人參皂苷Rg3 （批號Z01D7X25885， 含有量98%） 對照品購于上海源葉生物科技有限公司。 參麥注射液由杭州正大青春寶有限公司提供（批號1706271、 1611071、1611081、 1611082， 10 mL／支）。 乙腈為色譜純（德國Merck 公司）； 其他試劑為分析純； 水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件和系統(tǒng)適應(yīng)性考察 Agilent Eclipse Plus C18色譜柱（2.1 mm×50 mm， 1.8 μm）； 流動相乙腈 （A） -水 （B）， 梯度洗脫 （0 ～10 min，19%A； 10 ～18 min， 19% ～23% A； 18 ～21 min；23%A； 21 ～31 min， 23% ～40% A； 31 ～40 min，40% ～45%A）； 體積流量0.3 mL／min； 柱溫30 ℃；檢測波長203 nm； 進(jìn)樣量1 μL， 理論塔板數(shù)按人參皂苷Rg1 計(jì)， 應(yīng)不低于5 000。 8 種成分與其他組分均能達(dá)到基線分離， 色譜圖見圖1。

圖1 各成分UHPLC 色譜圖Fig.1 UHPLC chromatograms of various constituents

2.2 對照品溶液制備 精密稱取人參皂苷Rg1（5.081 mg）、 人參皂苷Re （3.579 mg）、 人參皂苷Rf （1.062 mg）、 人參皂苷Rb1 （10.061 mg）、 人參皂苷Rc （5.023 mg）、 人參皂苷Rb2 （5.033 mg）、人參 皂 苷 Rd （10.011 mg）、 人 參 皂 苷 Rg3（0.901 mg） 對照品， 置于1 mL 量瓶中， 20%乙腈溶解并稀釋至刻度， 制成貯備液， 精密吸取適量至10 mL 量瓶中， 加初始比例流動相至刻度， 制成分別含人參皂苷Rg1、 Re、 Rf、 Rb1、 Rc、 Rb2、 Rd、Rg3 0.390、 0.170、 0.072、 0.790、 0.308、0.220、 0.139、 0.019 mg／mL 的溶液， 即得。

2.3 供試品溶液制備 將注射液過0.22 μm 微孔濾膜， 棄初濾液3 滴后收集續(xù)濾液， 即得。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2” 項(xiàng)下對照品溶液適量， 制成5 個質(zhì)量濃度 （表1）， 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣1 μL 測定。 以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）， 峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸， 結(jié)果見表2， 可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性濃度范圍（mg／mL）Tab.1 Linear concentration ranges of various constituents （mg／mL）

2.5 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液 （批號1706271）， 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6次， 測得人參皂苷Rg1、 Re、 Rf、 Rb1、 Rc、 Rb2、Rd、 Rg3 峰 面 積RSD 分 別 為0.53%、 1.29%、2.21%、 0.55%、 0.64%、 0.43%、 0.66%、 2.71%，表明儀器精密度良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一注射液 （批號1706271）， 按“2.3” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液， 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6 次，測得人參皂苷Rg1、 Re、 Rf、 Rb1、 Rc、 Rb2、 Rd、Rg3 含有量RSD 分別為1.39%、 2.32%、 1.73%、0.54%、 0.41%、 2.57%、 0.39%、 1.05%， 表 明該方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密吸取含有量已知的供試品溶液 （批號1706271） 0.5 mL， 精密加入“2.4” 項(xiàng)下對照品溶液0.5 mL， 充分混勻， 平行6 份， 過0.22 μm 微孔濾膜， 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定， 計(jì)算回收率。結(jié)果， 人參皂苷Rg1、 Re、 Rf、 Rb1、 Rc、 Rb2、 Rd、 Rg3 平均加樣回收率 （RSD） 分別為98.64% （1.39%）、98.00% （ 2.19%）、 97.43% （ 1.05%）、 97.95%（0.37%）、 104.24%（5.34%）、 100.43 （1.00%）、99.68% （2.62%）、 100.91% （0.91%）。

2.8 樣品含有量測定 取4 批注射液， 過0.22 μm微孔濾膜， 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定， 計(jì)算含有量， 結(jié)果見表3。

表3 各成分含有量測定結(jié)果（mg／mL， n＝6）Tab.3 Results of content determination of various constituents （mg／mL， n＝6）

3 討論

前期查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)， 不同類型人參皂苷的結(jié)構(gòu)十分相似， 分離難度較大， 故在文獻(xiàn)報(bào)道基礎(chǔ)上采用梯度洗脫方式［9-10］。 本實(shí)驗(yàn)考察了不同流動相系統(tǒng)對分離效果的影響， 如乙腈-水、 0.05% KH2PO4緩沖鹽-乙腈等， 最終確定乙腈-水作為流動相進(jìn)行梯度洗脫； 考察了柱溫（20、 25、 30、 35、 40 ℃）和體積流量（0.1、 0.2、 0.3、 0.4、 0.5 mL／min）對分離度的影響， 發(fā)現(xiàn)30 ℃、 0.3 mL／min 下各色譜峰分離度最優(yōu)， 并且能保持柱壓在合理范圍內(nèi)；考察了進(jìn)樣量對分離度的影響， 發(fā)現(xiàn)1 μL 時色譜峰峰形最佳， 而大于1 μL 時峰形較差， 小于1 μL時峰面積太小。

根據(jù)Van Deemter 理論， 色譜柱粒徑越小， 塔板數(shù)高度越低， 柱效越高， 本實(shí)驗(yàn)采用1.8 μm 小顆粒填料色譜柱， 35 min 內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)參麥注射液中8 種人參皂苷的有效分離， 可大大提高分析效率。與常規(guī)HPLC 法相比， 在所測皂苷類成分含有量基本一致的情況下［11］UHPLC 法可節(jié)省近60 min， 故本實(shí)驗(yàn)采用該方法測定時可為快速全面評價(jià)參麥注射液質(zhì)量提供參考。