徐瑾 李衛(wèi)紅 陳國(guó)斌

作者單位：518028 深圳市婦幼保健院婦科

子宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤, 我國(guó)每年約有超過100000的新發(fā)病例, 是嚴(yán)重危害女性健康的常見惡性腫瘤［1］?；熓菍m頸癌的重要治療方式, 以鉑類藥物為基礎(chǔ)的化療是宮頸癌化療的一線選擇, 其中順鉑是常用的宮頸癌化療藥物［2］。腫瘤細(xì)胞耐藥可致化療欠佳, 使患者得不到有效的治療而死于癌癥；化療藥物耐藥是目前腫瘤治療面臨的難題, 但腫瘤耐藥的機(jī)制目前尚不清楚。惡性腫瘤細(xì)胞由于生長(zhǎng)迅速而使細(xì)胞微環(huán)境處于缺氧狀態(tài), 缺氧可使瘤細(xì)胞對(duì)化療的抗性增加, 故目前研究認(rèn)為腫瘤細(xì)胞微環(huán)境缺氧是腫瘤產(chǎn)生耐藥的重要原因［3,4］。缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia induced factor 1α, HIF-1α)是細(xì)胞在缺氧狀態(tài)下穩(wěn)定表達(dá)的核轉(zhuǎn)錄因子, 可在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控諸多靶基因的表達(dá)從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的化療耐藥, 已報(bào)道與多種惡性腫瘤鉑類耐藥有關(guān)［4,5］。但在宮頸癌方面研究報(bào)道較少, 本研究擬siRNA沉默宮頸癌Hela細(xì)胞的HIF-1α基因, 觀察缺氧培養(yǎng)條件下hela細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性, 探討宮頸癌順鉑耐藥的機(jī)制, 為減少宮頸癌化療耐藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 順鉑(上海阿拉丁生化科技股份有限公司), Lipofectamine3000(Invitrogen), CCK-8(上海碧云天),RT-PCR試劑盒(TAKARA), HIF-1α試劑盒(Abcam),AnnexinV-FITC-FITC/PI凋 亡 檢 測(cè) 試 劑 盒 (solarbio)。HIF-1α siRNA 由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成, 包含1條目的 siRNA鏈和1條陰性對(duì)照, si-HIF-1α：Forward：5’GATCCCGCACAGTTACAGTA TTCCATCA AGAGTG GAATACTGTAACTGTGCTTTITT-3’, Reverse：5’-CTAGAAAAAAGCACA GTTACAGTATCCACTCTTGATGGAAT ACTGTAACTGTGCGG-3’。引物由上海生工合成。三氣培養(yǎng)箱(NU4950型), 熒光定量PCR儀(BIO-RAD), 酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO TEK), 流式細(xì)胞儀 (BIO-RAD), 超靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(BIO-RAD)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 宮頸癌細(xì)胞株Hela細(xì)胞購于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫, 用含10%胎牛血清的RPMI Medium 1640 basic培養(yǎng)基培養(yǎng), 青霉素和鏈霉素濃度均為100 U/ml, 在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及處理 將Hela 細(xì)胞接種于6孔板中, 待細(xì)胞融合達(dá)到40～50%時(shí), 每孔加入900 μl Optimen@I Medium。將 3 μl的 Lipofectamine3000 和 5 μl的 siRNA 分別與 50 μl的Optimen@I Medium輕輕混勻, 靜置 5 min, 然后將上述混合液輕輕混勻, 靜置20 min后分別加入相應(yīng)實(shí)驗(yàn)分組中。實(shí)驗(yàn)分四組：①正常氧培養(yǎng)組(對(duì)照組)②低氧組(單純低氧培養(yǎng)) ③低氧陰性對(duì)照組(低氧培養(yǎng)并轉(zhuǎn)染siRNA陰性對(duì)照鏈)④實(shí)驗(yàn)組(低氧培養(yǎng)并轉(zhuǎn)染si-HIF-1α鏈)。

1.4 WB 和RT-PCR檢測(cè)HIF-1α蛋白及其mRNA 將1.3轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)48 h后收集, Trizol法提取mRNA,RT-PCR法檢測(cè)mRNA含量, HIF-1α引物：Forward：5’GCCAGATGATC ATGCAGCTACT-3’, Reverse ：5’-TGCTCCCTTCCATTCTGTTCAC-3’, 按試劑盒說明進(jìn)行操作。72 h后收集細(xì)胞, RIPA裂解液提取蛋白, PAGE凝膠電泳分離蛋白, PVDF轉(zhuǎn)膜, 5%脫脂牛奶封閉, HIF-1α抗體封閉過夜, 二抗孵育1 h后上機(jī)顯影。

1.5 CCK-8法檢測(cè)Hela細(xì)胞的藥物敏感性 將1.3轉(zhuǎn)染的細(xì)胞制成懸液, 以1×105/ml 的細(xì)胞密度接種于96孔板, 每孔加入100 μl細(xì)胞懸液, 每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔, 培養(yǎng)72 h后分別加入含 2、4、8、16、32 μg/ml 順鉑的培養(yǎng)液 100 μl, 24 h 后每孔加入10 μl CCK-8, 培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h后酶標(biāo)儀上測(cè)定450 nm處的吸光度值(OD), 據(jù)平均OD值計(jì)算出藥物IC50。

1.6 CCK-8法檢測(cè)順鉑對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響 將1.3轉(zhuǎn)染的細(xì)胞制成懸液, 以5×104/ml 的細(xì)胞密度接種于96孔板,每孔加入100 μl細(xì)胞懸液, 每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔, 培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁加入含5 μg/ml順鉑的完成培養(yǎng)基100 μl, 分別于藥物作用的0、24、48、72、96 h行CCK-8檢測(cè), 每孔加入10 μl CCK-8, 培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h后酶標(biāo)儀上測(cè)定450 nm處的吸光度值(OD), 根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 將1.3轉(zhuǎn)染的細(xì)胞制成懸液, 以2×105/ml 的細(xì)胞密度接種于6孔板, 每孔加入1 ml細(xì)胞懸液, 培養(yǎng)72 h后加入含5 μg/ml順鉑的完成培養(yǎng)基1 ml,藥物作用24 h后去除培養(yǎng)液, PBS洗滌2次后加不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞, 離心后PBS洗滌2次加入Binding Buffer重懸細(xì)胞 , 加入 10 μl Annexin V-FITC 和 5 μl Popidium Iodide,輕輕混勻, 室溫避光孵育15 min后上機(jī)檢測(cè)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示, 采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗(yàn)或Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同氧濃度度培養(yǎng)下Hela細(xì)胞HIF-1α表達(dá)及細(xì)胞增殖 HIF-1α是細(xì)胞缺氧狀態(tài)下表達(dá)的核轉(zhuǎn)錄因子。HIF-1α在15%、10%和5%氧濃度培養(yǎng)下其蛋白表達(dá)明顯增加。HIF-1α mRNA在低氧培養(yǎng)下高表達(dá), 20%氧濃度組明顯低于15%、10%和5%組, 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。15%氧濃度高于5%組, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。15%氧濃度高于10%組, 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。在細(xì)胞增殖方面, 適度缺氧可以促進(jìn)細(xì)胞增殖,CCK8檢測(cè)示15%和10%氧濃度培養(yǎng)其OD值明顯高于20%氧濃度培養(yǎng), 在72 h后差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而過度的缺氧可抑制細(xì)胞增殖, 5%氧濃度培養(yǎng)其OD值明顯低于20%、15%和10%氧濃度培養(yǎng)。而15%和10%氧濃度培養(yǎng), 72 h前兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05), 但96 h后15%氧濃度組OD值高于10%氧濃度組, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖1。因此本實(shí)驗(yàn)選擇15%氧濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的缺氧培養(yǎng)。

2.2 si-HIF-1α處理后HIF-1α蛋白及其mRNA的表達(dá)對(duì)照組HIF-1α蛋白表達(dá)較低, 而低氧組和低氧陰性對(duì)照組HIF-1α蛋白表達(dá)明顯升高, 實(shí)驗(yàn)組si-HIF-1α轉(zhuǎn)染后低氧培養(yǎng)其HIF-1α蛋白表達(dá)明顯下降, 低于低氧組和低氧陰性對(duì)照組, 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。HIF-1αmRNA在低氧組和低氧陰性對(duì)照組表達(dá)明顯高于對(duì)照組, 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)組si- HIF-1α轉(zhuǎn)染后低氧培養(yǎng)其HIF-1αmRNA表達(dá)明顯下降, 低于低氧組和低氧陰性對(duì)照組, 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05), 而實(shí)驗(yàn)組HIF-1αmRNA表達(dá)高于對(duì)照組, 差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見圖2。

2.3 不同氧濃度培養(yǎng)下Hela細(xì)胞的順鉑IC50 20%氧濃度組IC50明顯低于15%、10%和5%組, 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。15%和5%氧濃度組IC50高于10%組, 三組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。后期實(shí)驗(yàn)選擇順鉑濃度為6 μg/ml。見表 1。

2.4 si-HIF-1α處理后Hela細(xì)胞缺氧下順鉑對(duì)Hela細(xì)胞的IC50 對(duì)照組IC50明顯低于低氧組和低氧陰性對(duì)照組, 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05), 低氧陰性對(duì)照組IC50高于低氧組, 但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。低氧陰性對(duì)照組IC50高于實(shí)驗(yàn)組, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

2.5 缺氧培養(yǎng)下順鉑對(duì)Hela細(xì)胞的活性抑制 順鉑對(duì)Hela細(xì)胞的抑制隨時(shí)間梯度逐漸增加, 在低氧培養(yǎng)48 h內(nèi)各組間順鉑對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；72、96 h低氧組及低氧陰性對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率明顯低于對(duì)照組, 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率高于低氧組及低氧陰性對(duì)照組,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；72、96 h實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率低于對(duì)照組, 但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表3。

2.6 低氧下順鉑對(duì)Hela細(xì)胞凋亡的影響 低氧組及低氧陰性對(duì)照組順鉑刺激24 h后細(xì)胞凋亡率分別為20.7%、23.7%,低于對(duì)照組的40.8%及實(shí)驗(yàn)組的37.6%, 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。見圖 3, 圖 4。

圖1 不同氧濃度培養(yǎng)Hela細(xì)胞HIF-1α表達(dá)及其細(xì)胞增殖

圖2 不同組別Hela細(xì)胞HIF-1α表達(dá)

表1 不同氧濃度培養(yǎng)下Hela細(xì)胞的順鉑IC50值比較( ±s, μg/ml)

表1 不同氧濃度培養(yǎng)下Hela細(xì)胞的順鉑IC50值比較( ±s, μg/ml)

注：與20%O2組比較, aP＜0.05

組別 IC50 20%O2組 4.79±0.23 15%O2組 6.04±0.27a 10%O2組 5.78±0.20a 5%O2組 6.03±0.62a

表2 不同組別Hela細(xì)胞的順鉑IC50值比較( ±s, μg/ml)

表2 不同組別Hela細(xì)胞的順鉑IC50值比較( ±s, μg/ml)

注：與對(duì)照組比較, aP＜0.05；與低氧組比較, bP＞0.05；與實(shí)驗(yàn)組比較,cP＜0.05

組別 IC50對(duì)照組 4.76±0.75低氧組 6.84±1.12a低氧陰性對(duì)照組 6.88±0.86bc實(shí)驗(yàn)組 5.64±0.61

表3 不同時(shí)間順鉑對(duì)Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率( ±s, %)

表3 不同時(shí)間順鉑對(duì)Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率( ±s, %)

注：與對(duì)照組比較, aP＜0.05；與實(shí)驗(yàn)組比較, bP＜0.05

組別 0 h 24 h 48 h 72 h 96 h對(duì)照組 0.8±0.11 10.2±1.64 19.8±1.64 31.8±4.14 39.0±3.81低氧組 0.6±0.89 10.0±1.58 17.0±1.58 24.2±3.56ab 27.4±2.30ab低氧陰性對(duì)照組 1.0±1.0 9.6±2.07 17.8±1.64 25.2±3.83ab 27.8±2.87ab實(shí)驗(yàn)組 0.6±0.89 10.2±0.84 19.6±1.34 30.2±1.30 34.1±4.3

圖3 低氧下順鉑對(duì)Hela細(xì)胞凋亡的影響

圖4 不同組別低氧下順鉑對(duì)Hela細(xì)胞凋亡比較

3 討論

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤, 嚴(yán)重危害女性的健康,我國(guó)每年約有27000人因?qū)m頸癌而死亡, 提高宮頸癌的療效和減少因癌致死率是目前臨床上亟待解決的問題［1］?；熓菍m頸癌重要治療的方法, 化療有高危因素、腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或者晚期宮頸癌患者必不可少的治療, 以順鉑為基礎(chǔ)的化療或者同步放化療可提高宮頸癌患者的5年生存率, 使宮頸癌患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)下降28%～50%, 尤其對(duì)于晚期或者全身多處轉(zhuǎn)移的患者［6］。順鉑為鉑的金屬絡(luò)合物, 可作用于DNA形成順鉑/DNA復(fù)合物從而破壞DNA的復(fù)制, 或與核蛋白結(jié)合導(dǎo)致DNA損傷, DNA復(fù)制障礙或損傷可通過P53、促分裂原活化蛋白激酶等介導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號(hào)的激活, 從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或細(xì)胞增殖抑制［7］。然而, 鉑耐藥是宮頸癌臨床治療中不可忽視的問題, 鉑耐藥是中晚期宮頸癌治療失敗因癌致死的原因之一［8］。腫瘤耐藥可能與腫瘤微環(huán)境低氧狀態(tài)有關(guān), 腫瘤在發(fā)生、發(fā)展過程中不斷的分裂增殖, 瘤體不斷增大, 而瘤體周圍血管不能相應(yīng)提供足夠的血供造成腫瘤細(xì)胞缺血缺氧, 腫瘤細(xì)胞為適應(yīng)低氧微環(huán)境改變而表達(dá)缺氧誘導(dǎo)因子(HIF), HIF誘導(dǎo)下游基因表達(dá)使腫瘤細(xì)胞適應(yīng)缺氧［9］。HIF-1α是HIF的氧調(diào)節(jié)亞單位, 是細(xì)胞低氧環(huán)境下發(fā)揮作用的重要核轉(zhuǎn)錄因子, 可在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控多個(gè)靶基因, 從而導(dǎo)致腫瘤耐藥的產(chǎn)生, 目前已報(bào)道HIF-1α與多種腫瘤耐藥相關(guān)［10,11］。但關(guān)于HIF-1α與宮頸癌順鉑耐藥的研究報(bào)道較少, 本研究擬低氧條件下培養(yǎng)宮頸癌Hela細(xì)胞, 觀察低氧培養(yǎng)條件Hela細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性, 探討HIF-1α與低氧誘導(dǎo)的耐藥的關(guān)系。課題組將Hela細(xì)胞于低氧條件下培養(yǎng)48 h和72 h后分別檢測(cè)HIF-1α蛋白及其mRNA的表達(dá), 結(jié)果顯示HIF-1α蛋白及其mRNA在低氧培養(yǎng)條件下明顯表達(dá), 而正常氧培養(yǎng)下表達(dá)不明顯, 說明HIF-1α是細(xì)胞受缺氧刺激而特異性表達(dá)的, 這與Kourti等［12］報(bào)道一致。但HIF-1α與Hela細(xì)胞順鉑耐藥有何關(guān)聯(lián), 課題組將Hela細(xì)胞低氧培養(yǎng)72 h后加入順鉑并檢測(cè)其IC50, 結(jié)果顯示低氧組IC50明顯高于對(duì)照組(P＜0.05), 實(shí)驗(yàn)組通過siRNA技術(shù)沉默HIF-1α基因后, 其IC50明顯低于低氧陰性對(duì)照組(P＜0.05), 由此可見低氧培養(yǎng)下Hela細(xì)胞合成的HIF-1α與順鉑耐藥密切相關(guān), 在其他腫瘤研究中亦有報(bào)道, GU等［13］通過siRNA技術(shù)敲除前列腺癌PC-3細(xì)胞的HIF-1α基因發(fā)現(xiàn)其提高順鉑的抗癌性。課題組進(jìn)一步研究低氧與Hela細(xì)胞耐藥的時(shí)間關(guān)系,觀察不同培養(yǎng)條件下Hela細(xì)胞在相同順鉑濃度作用下的生長(zhǎng)抑制情況, 在順鉑用藥的48 h內(nèi)各組間Hela細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05), 但72、96 h低氧組和低氧陰性對(duì)照組其細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率明顯低于對(duì)照組(P＜0.05), 而實(shí)驗(yàn)組由于通過基因技術(shù)敲除HIF-1α, 其生長(zhǎng)抑制率明顯低于低氧陰性對(duì)照組(P＜0.05), 從時(shí)間梯度可見隨低氧培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)Hela細(xì)胞表達(dá)HIF-1α明顯增加, HIF-1α的表達(dá)可促進(jìn)Hela細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥。耐藥可抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡, 腫瘤細(xì)胞在化療藥物的作用下仍可繼續(xù)增殖, 課題組進(jìn)一步研究低氧對(duì)Hela細(xì)胞凋亡的影響, 將Hela細(xì)胞低氧培養(yǎng)72 h后加入順鉑, 24 h后流式細(xì)胞儀檢測(cè)Hela細(xì)胞凋亡, 結(jié)果顯示低氧組及低氧陰性對(duì)照組其凋亡率均明顯低于實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組(P＜0.05), 由此可見低氧可抑制順鉑誘導(dǎo)的Hela細(xì)胞凋亡, 而抑制凋亡的機(jī)制與細(xì)胞低氧下表達(dá)的HIF-1α相關(guān)。

綜上所述, 本研究認(rèn)為Hela細(xì)胞在低氧條件表達(dá)HIF-1α,HIF-1α可促進(jìn)細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥, 抑制細(xì)胞凋亡, 從而促進(jìn)腫瘤繼續(xù)增殖；而敲除HIF-1α基因的表達(dá)可抑制低氧誘導(dǎo)的順鉑耐藥, HIF-1α與Hela細(xì)胞的化療藥物耐藥密切相關(guān), 阻斷HIF-1α的表達(dá)對(duì)于提高化療藥物的腫瘤抗性具有重要的意義。但HIF-1α是通過何種機(jī)制介導(dǎo)Hela細(xì)胞順鉑耐藥, 其機(jī)制尚不清楚, 將在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。