田學斌 劉海洋 李佳慧 董郭楓 周鐵麗 陳櫟江 曹建明

肺炎克雷伯菌是常見的醫(yī)院感染病原體[1]。近年來，由于廣譜抗菌藥物的廣泛使用甚至濫用，導致多重耐藥菌不斷出現(xiàn)，給臨床抗感染治療帶來極大的困難[2]。細菌生物膜是細菌在群體生長過程中出現(xiàn)的一種特定現(xiàn)象，是細菌及其分泌的含水聚合性基質(zhì)（主要是胞外多糖）黏附在物體或生物組織表面形成的結(jié)構(gòu)性細菌群落[3]，約80%醫(yī)院感染與生物膜相關(guān)，而且生物膜能通過各

種機制增加細菌的耐藥性[4]。一旦感染部位的細菌形成生物膜，即使抗菌藥物的使用劑量達到正常劑量的成百倍，也很難消除生物膜引起的感染[5]。因此，細菌生物膜已成為研究者們關(guān)注的焦點之一。但目前關(guān)于細菌生物膜如何使細菌對抗菌藥物耐藥性增強的相關(guān)分子機制的研究資料仍然較少。本研究主要對肺炎克雷伯菌臨床分離菌株生物膜形成能力進行初步探討，并對生物膜形成相關(guān)基因的表達水平進行分析，為進一步研究生物膜形成機制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株來源 收集2013年1月至2015年6月溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院住院患者分離得到的肺炎克雷伯菌500株，剔除同一患者相同部位重復分離的菌株，其中包括200株對亞胺培南、頭孢他啶、環(huán)丙沙星和慶大霉素敏感的肺炎克雷伯菌（敏感組）和300株對上述藥物耐藥的肺炎克雷伯菌（耐藥組），藥敏結(jié)果判讀參照美國臨床實驗室標準化研究協(xié)會（CLSI）2015標準。質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC13883、ATCC700603購自衛(wèi)生部臨床檢驗中心。

1.2 儀器和試劑 VITEK 2 Compact全自動微生物分析儀（法國梅里埃公司）；熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司）；全功能微孔板檢測酶標儀（美國Biotek公司）；離子濺射儀（英國Cressington公司）；掃描電鏡（德國卡爾蔡司公司）；PCR反應試劑盒（大連Takara有限公司）；96孔細胞培養(yǎng)板、6孔細胞培養(yǎng)皿（美國康寧公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Thermo公司）；實時熒光定量PCR檢測試劑盒（日本Toyobo公司）；1%結(jié)晶紫染液（北京索萊寶科技有限公司）。

1.3 96孔板結(jié)晶紫染色法測定生物膜形成能力 生物膜形成試驗采用半定量結(jié)晶紫染色法[6]。將菌液調(diào)至1.5×108CFU/ml。取 10μl菌液加入到含 190μl LB 的 96孔板中，同時作3個復孔，并作空白對照。靜置培養(yǎng)18h后用結(jié)晶紫染色，無水乙醇洗脫，測定OD590值，計算3個復孔的平均吸光度值。實驗重復3次，取平均值。參考文獻標準[7]，結(jié)合實驗過程中生物膜的染色結(jié)果，將生物膜形成能力按照OD590測定值作以下分類：強生物膜形成能力（OD590＞0.500），中等生物膜形成能力（0.200≤OD590≤0.500），弱生物膜形成能力（OD590＜0.200）。

1.4 掃描電鏡觀察生物膜形成能力 生物膜培養(yǎng)參照文獻[8]進行，選取生物膜形成能力強、中、弱菌株各1株，挑取菌落接種至LB肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜離心，棄上清液，采用PBS緩沖液重懸菌液并調(diào)節(jié)菌懸液濃度至0.5麥氏濁度；將上述菌液1∶1 000稀釋，將無菌蓋玻片放入無菌6孔細胞培養(yǎng)皿孔中；每孔各加入稀釋后的菌液2ml，37℃靜置培養(yǎng)24h后即可形成生物膜，每株菌設(shè)置2個復孔；將6孔細胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液棄去，將PBS緩沖液滴加于蓋玻片上，靜置，重復3次。將蓋玻片放置于含有戊二醛的無菌6孔細胞培養(yǎng)板中4℃固定 1h，再用系列梯度濃度（50%、70%、80%、90%、95%和100%）乙醇分別脫水6min，之后進行干燥。將干燥完成的標本放進離子濺射儀鍍膜室進行60s的鍍膜處理。通過電鏡捕捉并保存圖像。

1.5 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測生物膜形成相關(guān)基因表達量 采用簡單隨機抽樣的方法選取同時攜帶可調(diào)控生物膜的Ⅱ型群體感應系統(tǒng)相關(guān)基因luxS，外排泵編碼基因oqxB、acrB，外排泵編碼基因的調(diào)控基因rarA、ramA，外膜蛋白相關(guān)基因ompK36，外膜蛋白相關(guān)基因調(diào)控基因micF的肺炎克雷伯菌共100株（陽性菌株均進行測序驗證），比較這些菌株生物膜形成相關(guān)基因的表達量（該組所有菌株相關(guān)基因表達量的平均值）與生物膜形成能力的關(guān)系。研究所用的目的基因和內(nèi)參基因引物的序列經(jīng)Primer Premier 6自行設(shè)計，經(jīng)primer-blast網(wǎng)站（http∶//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primerblast/）驗證其特異性，見表1。取每個樣本3個復孔的平均值，計算生物膜形成相關(guān)基因的表達量，采用2-ΔΔCt公式計算生物膜形成相關(guān)基因表達量差異，肺炎克雷伯菌ATCC700603為對照菌株，管家基因rpoB為內(nèi)參基因，以外排泵基因oqxB為例，如下所示：

ΔCt（試驗樣本）=Ct（試驗樣本oqxB基因）-Ct（試驗樣本rpoB基因）

ΔCt（校準樣本）=Ct（ATCC700603的oqxB基因）-Ct（ATCC700603的rpoB基因）

-ΔΔCt=ΔCt（校準樣本）-ΔCt（試驗樣本）

2-ΔΔCt即為外排泵基因oqxB的表達量。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。正態(tài)分布的計量資料用表示，兩樣本比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗；計量資料組間比較采用χ2檢驗；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 肺炎克雷伯菌生物膜形成能力的對比 500株肺炎克雷伯菌中，強生物膜形成能力肺炎克雷伯菌243株（48.6%），中等生物膜形成能力肺炎克雷伯菌197株（39.4%），弱生物膜形成能力肺炎克雷伯菌60株（12.0%）。肺炎克雷伯菌中各菌株的生物膜形成能力之間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），強形成能力組平均生物膜形成量為弱形成能力組的16.8倍（1.498/0.089）。耐藥組和敏感組肺炎克雷伯菌株生物膜OD590的平均值分別為0.672±0.534和0.783±0.642，兩者生物膜形成能力的差異無統(tǒng)計學意義。另外，耐藥組按照生物膜形成能力強、中、弱等級分類后的比例分別為45.7%、42.0%、12.3%，敏感組分別為53.0%、35.5%、11.5%，3種生物膜等級強度的菌株在兩組中的分布差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

表1 qRT-PCR引物序列

2.2 掃描電鏡觀察肺炎克雷伯菌生物膜形成能力 根據(jù)前述檢測結(jié)果，選取生物膜形成能力強、中、弱各1株菌株作掃描電鏡檢測，觀察鏡下生物膜狀態(tài)。結(jié)果見圖1（見插頁）：生物膜形成能力較強的菌株生物膜數(shù)量較多，鋪滿整個視野，細菌在內(nèi)部縱橫交織；中等生物膜形成能力的菌株，生物膜數(shù)量相對減少，密度下降；生物膜形成能力較弱的菌株生物膜數(shù)量明顯減少，密度明顯下降，細菌小部分聚集。

2.3 不同生物膜形成能力組生物膜形成相關(guān)基因表達量分析 不同生物膜形成能力組菌株之間luxS基因表達水平的差異有統(tǒng)計學意義，強生物膜形成能力組（25株）luxS表達水平分別為生物膜形成能力中等（44株）和弱生物膜形成組（31株）的5.98倍（0.956/0.160）和3.37 倍（0.956/0.284）（均P＜0.05）。此外，oqxB、ompK36和micF及rarA、acrB、ramA表達水平差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。見表2。

表2 不同生物膜形成能力肺炎克雷伯菌生物膜相關(guān)基因表達譜

肺炎克雷伯菌的生物膜形成能力與其相關(guān)基因表達量的關(guān)系錯綜復雜。結(jié)果見表3，生物膜數(shù)量和luxS、micF之間呈正相關(guān)；luxS與acrB及ramA、rarA，以及ompK36、micF之間呈正相關(guān)；oqxB與rarA及acrB之間呈正相關(guān)；rarA作為oqxB的調(diào)控基因，與acrB、ramA以及micF之間呈正相關(guān)；acrB與ramA和ompK36、micF之間呈正相關(guān)；ompK36與micF之間也呈正相關(guān)。

3 討論

肺炎克雷伯菌可引起社區(qū)和院內(nèi)多種感染，臨床分離肺炎克雷伯菌易形成生物膜的特點也提高了它們對抗菌藥物的耐藥水平[9]。目前關(guān)于多重耐藥肺炎克雷伯菌生物膜形成能力的報道仍然較少，本研究通過半定量結(jié)晶紫染色法和電鏡掃描證實肺炎克雷伯菌的生物膜形成能力，并進一步研究肺炎克雷伯菌生物膜形成能力及基因的相關(guān)性，希望找到對抗生物膜的有效途徑。本研究結(jié)果顯示肺炎克雷伯菌有較強的生物膜形成能力（48.6%），但多重耐藥肺炎克雷伯菌的生物膜形成能力與敏感組差異無統(tǒng)計學意義，雖然肺炎克雷伯菌對藥物的耐藥性與其攜帶的耐藥基因以及形成生物膜有關(guān)，細菌形成生物膜后可以大大降低抗菌藥物對其的清除效率，但是耐藥菌株并不一定攜帶相應的生物膜形成基因，也不一定都可以形成強的生物膜，此外，敏感菌株也部分攜帶生物膜形成相關(guān)基因。因此，筆者認為肺炎克雷伯菌生物膜形成能力主要與細菌本身是否攜帶相應的生物膜相關(guān)基因以及細菌本身的表面特性有關(guān)[10]。

表3 肺炎克雷伯菌生物膜量與其相關(guān)基因表達量相關(guān)性分析（r值）

多項研究證實luxS基因可調(diào)控臨床病原菌生物膜的形成，如大腸埃希菌、肺炎鏈球菌和肺炎克雷伯菌等[11-13]。本文結(jié)果顯示：強生物膜形成能力組luxS基因的表達水平分別是中等生物膜形成能力組和弱生物膜形成組的5.98倍和3.37倍，筆者分析，luxS作為高階調(diào)控基因，在生物膜形成的過程中起主要調(diào)控作用，但肺炎克雷伯菌生物膜形成能力除了與luxS基因表達量有關(guān)外，還受細菌黏附等因素的影響，具體調(diào)控機制尚需進一步研究。

在肺炎克雷伯菌中關(guān)于外排泵的研究主要涉及到外排泵、外膜蛋白缺失介導的細菌多重耐藥等相關(guān)機制，但缺乏外排泵等與細菌生物膜形成之間的關(guān)系的研究，本研究探討了肺炎克雷伯菌多重耐藥相關(guān)的luxS、oqxB，rarA、acrB、ramA，ompK36以及micF與生物膜形成的關(guān)系，結(jié)果顯示luxS基因表達水平與外排泵和外膜蛋白編碼基因及其調(diào)控基因的表達水平之間存在一定的相關(guān)性，且各個外排泵和外膜蛋白編碼及其調(diào)控基因的表達水平之間也具有相關(guān)性。而其他外排泵基因以及調(diào)控基因在生物膜形成中的作用，則需進一步通過敲除等試驗驗證。

綜上所述，luxS作為一個高階調(diào)控基因，與上述各基因之間構(gòu)成錯綜復雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)共同決定了肺炎克雷伯菌形成生物膜的能力。本研究首次較為深入地研究了肺炎克雷伯菌生物膜形成能力與多種外排泵基因、外排泵調(diào)控基因、外膜蛋白基因之間的相關(guān)性，為有效防控病原菌生物膜相關(guān)感染提供了一定的理論依據(jù)。