栗 靜，霍麗娟

山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院消化內(nèi)科，山西 太原 030000

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是結(jié)腸黏膜的慢性非特異性炎性疾病，屬炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)的主要類型。UC的病因及發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，其發(fā)生被認(rèn)為與感染、免疫、遺傳和環(huán)境等諸多因素相關(guān)，越來(lái)越多的研究表明，免疫異常在UC發(fā)生和發(fā)展的過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[1-2]。

UC患者存在腸道菌群失調(diào)，在各種微生物抗原刺激下，激活體內(nèi)免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致細(xì)胞因子的失衡，各種炎癥細(xì)胞活化，產(chǎn)生腸道的慢性炎癥反應(yīng)。此過(guò)程可由Toll樣受體4(TLR4)介導(dǎo)。Toll樣受體(Toll like receptors，TLRs)是一種細(xì)胞跨膜蛋白，通過(guò)對(duì)病原微生物的識(shí)別觸發(fā)信號(hào)傳導(dǎo)通路從而激活免疫系統(tǒng)。其中，TLR4被認(rèn)為是促進(jìn)UC發(fā)病的重要免疫因素[3]。TLR4在人類正常結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞中呈低表達(dá)，而在UC患者的結(jié)腸黏膜中呈高表達(dá)，可以特異性識(shí)別格蘭陰性菌的細(xì)胞壁成分脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)[4-5]，從而介導(dǎo)腸上皮細(xì)胞對(duì)LPS的高反應(yīng)性，參與腸道黏膜屏障和共生內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。UC患者結(jié)腸黏膜上皮屏障發(fā)生損傷，使腸黏膜上皮直接暴露于大量腸道菌群，TLR4的表達(dá)上調(diào)，明顯增加了黏膜上皮細(xì)胞對(duì)LPS的敏感性，LPS通過(guò)誘導(dǎo)TLR4二聚體化啟動(dòng)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并通過(guò)下游的信號(hào)傳導(dǎo)分子髓樣分化因子(myeloid differentiation factor 88，MyD88)進(jìn)行胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，導(dǎo)致核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)激活，促進(jìn)下游炎癥因子如TNF-α、IL-6等的表達(dá)，從而破壞腸道免疫穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致UC發(fā)生[6]。

腎上腺髓質(zhì)素(adrenomedullin，AM)是一種血管活性肽，廣泛分布于正常腎上腺髓質(zhì)、心臟、肺、腎、胃腸道、血漿和尿液中[7]。以往研究表明，AM有抑炎、抗菌、保護(hù)腸黏膜屏障并降低腸黏膜通透性等作用。在臨床應(yīng)用方面，能夠使難治性UC患者臨床癥狀緩解、鏡下炎癥浸潤(rùn)減輕，且無(wú)明顯的不良反應(yīng)發(fā)生，從而推測(cè)AM可能成為一種有效治療UC的藥物[8-9]。AM已被證實(shí)可以通過(guò)抑制NF-κB活化，下調(diào)NF-κB p65的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)免疫與炎癥反應(yīng)，對(duì)UC動(dòng)物模型起保護(hù)作用，但是否與TLR4介導(dǎo)的MyD88/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)尚缺乏相關(guān)報(bào)道[10-11]。本實(shí)驗(yàn)中我們采用DSS誘導(dǎo)小鼠UC模型，通過(guò)外源性給予AM，觀察AM對(duì)UC小鼠的作用，并探討其可能的作用機(jī)制，為臨床UC的治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑清潔級(jí)♂C57BL/6小鼠30只，鼠齡6～8周，購(gòu)自中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院試驗(yàn)動(dòng)物中心，標(biāo)準(zhǔn)飲食，自由飲水。AM購(gòu)自吉爾生化公司，TLR4抗體(貨號(hào)：13556)、MyD88抗體(貨號(hào)：2068)、NF-κB抗體(貨號(hào)：16502)和β-Actin(貨號(hào)：8227)購(gòu)自基因美科技有限公司，NF-κB ELISA試劑盒(貨號(hào)：JYM0102Mo)、TNF-α ELISA試劑盒(貨號(hào)：JYM0218Mo)及IL-6 ELISA試劑盒(貨號(hào)：JYM0012Mo)購(gòu)自基因美科技有限公司。

1.2方法

1.2.1 動(dòng)物分組及UC模型建立：30只清潔級(jí)♂C57BL/6小鼠隨機(jī)分為3組：正常對(duì)照組、模型組、AM干預(yù)組，每組10只，體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用COOPER等[12]的經(jīng)典方法造模，模型組和AM干預(yù)組給予質(zhì)量濃度為40 g/L的DSS水溶液自由飲用7 d，建立小鼠急性UC模型，正常對(duì)照組小鼠給予自來(lái)水自由飲用。

1.2.2 藥物干預(yù)及標(biāo)本處理：造模期間觀察各組小鼠精神狀態(tài)、皮毛光澤度、飲食情況、大便性狀、記錄小鼠體質(zhì)量改變，對(duì)小鼠進(jìn)行疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activity index，DAI)評(píng)分，DAI=(體質(zhì)量分?jǐn)?shù)+大便性狀評(píng)分+大便潛血評(píng)分)/3。評(píng)估模型建立成功后，各組小鼠恢復(fù)正常飲水，對(duì)照組和模型組給予生理鹽水每天0.5 ml/只灌腸，AM組每天給予0.5 μg/(ml·只)灌腸，連續(xù)灌腸7 d后，眼球取血，室溫靜置1 h后3 000 r/min離心10 min(離心半徑為12.5 cm)，取上層血清，凍存于-20 ℃待檢。解剖小鼠，分離結(jié)腸，量取結(jié)腸長(zhǎng)度后記錄。摘除結(jié)腸外壁脂肪組織及腸系膜等雜質(zhì)，沿腸系膜緣縱軸剖開(kāi)結(jié)腸后用冰生理鹽水清洗腸壁及內(nèi)容物，低溫下肉眼觀察結(jié)腸大體損傷情況，采用大體形態(tài)損傷指數(shù)(colon macroscopic damage index，CMDI)[13]評(píng)分，評(píng)估其結(jié)腸黏膜損傷程度。留取病變明顯的結(jié)腸組織標(biāo)本，部分結(jié)腸組織用質(zhì)量濃度為40 g/L的多聚甲醛固定，余下凍存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 結(jié)腸組織病理學(xué)檢測(cè)：將小鼠結(jié)腸組織置于質(zhì)量濃度為40 g/L的多聚甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm切片，進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)觀察，并進(jìn)行結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分[14]。

1.2.4 ELISA檢測(cè)血清NF-κB、TNF-α、IL-6表達(dá)：小鼠血清中NF-κB、TNF-α、IL-6蛋白水平的測(cè)定嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，450 nm的波長(zhǎng)測(cè)量各孔的OD值，根據(jù)OD值和標(biāo)準(zhǔn)品的濃度得出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，代入OD值計(jì)算樣品濃度。

1.2.5 Western blotting檢測(cè)結(jié)腸組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)：將所取腸組織標(biāo)本研磨粉碎后，加入6倍劑量的冷蛋白裂解液制緩沖液。每樣品取20 μg蛋白上樣，根據(jù)蛋白分子量配置SDS-PAGE凝膠電泳，濃縮膠80 V 40 min，分離膠120 V 50 min后，當(dāng)染料到達(dá)膠底部時(shí)即可終止電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。質(zhì)量濃度為50 g/L的脫脂奶封閉2 h，加入一抗：TLR4(1∶500)、MyD88(1∶1 000)、NF-κB(1∶2 000)、β-actin(1∶1 000)封閉過(guò)夜。根據(jù)一抗來(lái)源，加入稀釋好的二抗，室溫孵育2 h，漂洗后，ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，分析膠片灰度值。

2 結(jié)果

2.1模型評(píng)估及體質(zhì)量改變DSS造模后，模型組與AM組小鼠相比，精神狀態(tài)變差，活動(dòng)量減少，體質(zhì)量減輕，大便變細(xì)變稀，嚴(yán)重者可見(jiàn)黏液膿血便，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中無(wú)動(dòng)物死亡。根據(jù)各組小鼠體質(zhì)量變化，繪制曲線圖。從圖1中可以看出，AM干預(yù)組小鼠在給予AM干預(yù)后體質(zhì)量減輕情況較模型組有明顯改善。

圖1 小鼠體質(zhì)量變化曲線 Fig 1 Body mass change curve in mice

2.2三組小鼠結(jié)腸DAI、CMDI及結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分模型組小鼠DAI、腸黏膜及組織學(xué)損傷評(píng)分均顯著高于正常對(duì)照組和AM干預(yù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見(jiàn)表1)。

表1 三組小鼠的DAI、CMDI及結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分Tab 1 The DAI, CMDI and histopathological score of colon tissues in three groups of mice

注：與正常對(duì)照組相比，*P<0.01；與模型組相比，△P<0.01。

正常對(duì)照組小鼠結(jié)腸黏膜色澤正常，光鏡下黏膜結(jié)構(gòu)完整，腺體排列整齊；模型組小鼠結(jié)腸出現(xiàn)擴(kuò)張水腫，腸壁增厚且與周圍組織粘連，剖開(kāi)可見(jiàn)多發(fā)潰瘍病灶，光鏡下部分腸黏膜壞死脫落，絨毛結(jié)構(gòu)破壞，腺體排列紊亂，可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，杯狀細(xì)胞減少，且伴有隱窩膿腫；AM干預(yù)組小鼠結(jié)腸黏膜輕度充血水腫，腺體排列尚整齊，未見(jiàn)明顯潰瘍形成，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較模型組明顯減輕(見(jiàn)圖2)。

圖2 小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)改變(HE 400×) A：正常對(duì)照組；B：模型組；C：AM干預(yù)組Fig 2 The pathological changes of mice colon tissues in different groups (HE 400×) A: normal control group; B: model group; C: AM intervention group

2.3三組小鼠結(jié)腸組織TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)與正常對(duì)照組相比，模型組TLR4、MyD88、NF-κB蛋白的表達(dá)水平均顯著升高(P<0.01)；給予AM干預(yù)后，三種蛋白的表達(dá)較模型組均降低(P<0.05，見(jiàn)圖3)。

注：1：正常對(duì)照組；2：模型組；3：AM干預(yù)組。與正常對(duì)照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。圖3 各組TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表達(dá)的變化Fig 3 Changes of TLR4, MyD88 and NF-κB proteins expressions in each group

2.4AM對(duì)小鼠血清NF-κB、TNF-α、IL-6的影響ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，NF-κB、TNF-α及IL-6在模型組小鼠血清中呈高表達(dá)(P<0.01)；而AM干預(yù)后，三者的表達(dá)較模型組均明顯降低(P<0.05，見(jiàn)圖4)。

注：1：正常對(duì)照組；2：模型組；3：AM干預(yù)組。與正常對(duì)照組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。圖4 各組小鼠血清NF-κB、TNF-α、IL-6的表達(dá)Fig 4 Expressions of serum NF-κB, TNF-α and IL-6 in mice of each group

3 討論

UC是一種非特異性腸道炎癥性疾病。近年來(lái)，隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展、人民生活水平的提高及現(xiàn)代飲食方式和生活作息的改變，UC在我國(guó)的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，逐漸成為我國(guó)消化系統(tǒng)常見(jiàn)病[15]。因此，研究UC的發(fā)病機(jī)制，對(duì)治療UC具有一定的臨床價(jià)值。目前為止，UC的發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，近年來(lái)研究表明[16]，腸道黏膜免疫系統(tǒng)紊亂與UC的病情發(fā)展密切相關(guān)。TLR4作為腸道重要的病原相關(guān)模式受體，在機(jī)體免疫系統(tǒng)激活介導(dǎo)的反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，細(xì)菌代謝產(chǎn)物往往通過(guò)激活跨膜TLR4及其介導(dǎo)的MyD88途徑誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生及聚集，參與免疫應(yīng)答，導(dǎo)致機(jī)體免疫及防御系統(tǒng)過(guò)度激活，體內(nèi)釋放大量炎癥因子，最終導(dǎo)致疾病的發(fā)生。陳曉等[17]發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸炎模型大鼠MyD88的表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組，且與炎癥程度相關(guān)，說(shuō)明MyD88可能是反映UC嚴(yán)重程度的參考指標(biāo)之一。NF-κB在UC的發(fā)生、發(fā)展中作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，是多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑的匯聚點(diǎn)，在調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)的基因中起關(guān)鍵作用。研究[18-19]發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，UC組的結(jié)腸組織NF-κB的表達(dá)增高，且NF-κB在UC患者腸道黏膜上皮、隱窩上皮和固有層單核細(xì)胞中高度表達(dá)，同時(shí)在細(xì)胞核的表達(dá)也明顯高于細(xì)胞質(zhì)。由此可見(jiàn)，TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路在UC致病過(guò)程中具有關(guān)鍵作用，抑制該信號(hào)通路或阻斷其任一環(huán)節(jié)的作用，可能減輕UC的炎癥反應(yīng)，從而起到臨床治療作用。本實(shí)驗(yàn)中，模型組小鼠TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路三種蛋白的表達(dá)均明顯增高，其血清中TNF-α、IL-6的表達(dá)也相應(yīng)增加，而采用AM進(jìn)行干預(yù)后，上述各節(jié)點(diǎn)蛋白及相關(guān)炎癥因子的表達(dá)均下調(diào)，提示AM可能是通過(guò)抗炎作用對(duì)UC小鼠起到了治療作用。

AM是一種由52個(gè)氨基酸組成的多肽，最早從人的嗜鉻細(xì)胞瘤中分離發(fā)現(xiàn)，具有多種生物學(xué)作用[7-8]。鑒于AM在胃和結(jié)腸組織中的高濃度表達(dá)，以往研究[20-21]表明，AM有保護(hù)腸黏膜屏障并顯著降低腸黏膜通透性的作用，可以在胃腸道上皮細(xì)胞中以自分泌或旁分泌的形式保護(hù)胃腸黏膜免受各種傷害，并促進(jìn)如胃潰瘍、IBD等疾病的愈合。ASHIZUKA等[22]認(rèn)為，AM可以通過(guò)抑制炎癥因子及發(fā)揮抗菌作用，從而對(duì)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎起到治療作用。彭穎等[11]研究表明，AM對(duì)TNBS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能是抑制了RhoA介導(dǎo)的NF-κB p65/MLCK信號(hào)通路的活化。近年來(lái)，有學(xué)者[23-24]進(jìn)行了臨床試驗(yàn)，通過(guò)靜脈輸注AM的方式治療難治性UC患者，結(jié)果證實(shí)AM可以使難治性UC患者臨床癥狀緩解、鏡下結(jié)腸黏膜炎癥浸潤(rùn)減輕，同時(shí)還可以刺激黏膜再生，并且發(fā)現(xiàn)無(wú)明顯的不良反應(yīng)，從而推測(cè)AM可能會(huì)成為今后一種臨床治療UC有效的藥物。然而，具體的作用機(jī)制卻鮮有報(bào)道。本次實(shí)驗(yàn)中，模型組大鼠DAI、CMDI及組織病理學(xué)損傷評(píng)分均顯著高于正常對(duì)照組和AM干預(yù)組，且給予AM干預(yù)后，AM干預(yù)組小鼠精神狀態(tài)變好，活動(dòng)量增加，體質(zhì)量增加，結(jié)腸組織損傷情況得到改善，TLR4、MyD88、NF-κB蛋白的表達(dá)明顯減少，炎癥因子TNF-α、IL-6的表達(dá)下調(diào)，進(jìn)一步驗(yàn)證了AM可能的作用機(jī)制。

綜上所述，AM可以改善DSS誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性UC小鼠的結(jié)腸損傷，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路，下調(diào)TNF-α、IL-6等炎癥因子表達(dá)，從而發(fā)揮對(duì)實(shí)驗(yàn)性UC小鼠的治療作用。但本實(shí)驗(yàn)只是對(duì)AM改善UC模型小鼠可能的作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討，更詳盡的機(jī)制仍需擴(kuò)大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)樣本量進(jìn)行深入的研究。