湯樣華，辛大偉，李國松，岳振雙，曾林如

（杭州市蕭山區(qū)中醫(yī)院 骨科，浙江 杭州 311201）

骨質(zhì)疏松癥是以全身性骨量減少，單位體積骨量降低，礦鹽和骨基質(zhì)比例減少，骨組織微觀結(jié)構退化為特征的疾病[1-2]。骨質(zhì)疏松癥主要包括原發(fā)性、繼發(fā)性和特發(fā)性3種類型，其中糖皮質(zhì)激素誘導的骨質(zhì)疏松癥是繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的最常見形式[3]，并因此導致骨密度（bone mineral density，BMD）降低和骨折風險增加。骨質(zhì)疏松癥屬于中醫(yī)“痿證”范疇，病變在骨，其本在腎，以補肝腎、強筋骨為治則。牛膝為莧科植物牛膝的干燥根，歸肝、腎經(jīng)，具有活血化瘀、補肝腎、強筋骨的作用。其中β-蛻皮甾酮（β-ecdysterone，β-Ecd）為牛膝的活性成分之一，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[4]，β-Ecd能以劑量依賴性的方式逆轉(zhuǎn)地塞米松對成骨細胞分化、增殖的抑制和減少成骨細胞凋亡。目前BMD的測定和骨代謝生化指標檢測是骨質(zhì)疏松癥的主要診斷手段。本研究通過使用潑尼松龍（prednisolone，Pred）誘導構建骨質(zhì)疏松癥大鼠模型，采用β-Ecd進行干預處理，觀察其對大鼠血清骨代謝指標及BMD的影響，進一步探討β-Ecd治療糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥的療效和作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料 β-Ecd購自上海純優(yōu)生物科技有限公司；潑尼松龍緩釋片購自鄭州靈瑞制藥有限公司；阿侖膦酸注射液購自石家莊英創(chuàng)醫(yī)藥科技有限公司；枸櫞酸鈉溶液購自上海Jrdun生物技術有限公司；2%牛血清白蛋白購自美國Sigma-Aldrich公司；Micro-CT及分析軟件購自瑞士SCANCO醫(yī)療公司；CX41RF顯微鏡購自上海巴玖實業(yè)有限公司；70-70型全自動生化分析儀購自日本日立公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組：30只清潔級雄性Wistar大鼠[由上海實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（滬）2016-0004]，鼠齡4周，體質(zhì)量180～220 g。所有大鼠被安置在25 ℃（濕度60%～70%）的環(huán)境中，光/暗周期為12 h，可自由獲取食物和水。將大鼠隨機分為5組，每組6只。

1.2.2 動物造模和給藥：對照組：未接受任何干預治療；Pred組：在大鼠后背皮下埋入1粒潑尼松龍緩釋型藥片（2.5 mg/粒）[5]，連續(xù)4周；Pred+β-Ecd（5 mg/kg）組：在Pred組用藥的同時，皮下注射β-Ecd（5 mg/kg），周一到周五，每日1次，連續(xù)4周；Pred+β-Ecd（10 mg/kg）組：在Pred組用藥的同時皮下注射β-Ecd（10 mg/kg），周一到周五，每日1次，連續(xù)4周；Pred+阿侖膦酸（Alendronic acid，ALN）組：在Pred組用藥的同時，皮下注射ALN（3 mg/kg）周一到周五，每日1次。

1.2.3 血清骨代謝指標檢測：造模完成后，在血清分離管中采集10 mL的血液，在室溫下用800×g離心10 min，在血清分離成功后1 h內(nèi)應用全自動生化分析儀測定血清鈣、磷濃度，抗酒石酸磷酸酶（tartrate-resistant phosp-hatase，TRAP）和堿性磷酸酶（alkaline phosp-hatase，ALP）活性。

1.2.4 Micro-CT測定骨結(jié)構和BMD：1個月后處死大鼠，取其第1～第5節(jié)腰椎。將大鼠第5節(jié)腰椎以3.7%中性甲醛溶液浸泡固定過夜，再浸入70%乙醇中固定24 h。用Micro-CT掃描，掃描部位為第5腰椎上下生長板之間。所用能量為70 keV，密度為85 μA。掃描213張圖（灰階圖），評估分析，以計算其骨小梁結(jié)構與厚度，并以Image Processing Language軟件處理模擬出3D結(jié)構圖。BMD以骨小梁體積（trabecular bone volume，TBV）、骨總體積（total bone volume，TBV）、骨體積分數(shù)（trabecular bone volume/total bone volume，TBV/TBV）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨表面積和組織體積的比值（bone surface/tissue volume，BS/TV）、骨小梁數(shù)量（trabeculae number，Tb.N）、骨小梁分離度（trabeculae separation，Tb.Sp）、結(jié)構模型指數(shù)（structural model index，SMI）表示。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料以 ±s表示，多組比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 血清骨代謝指標檢測結(jié)果 與對照組比，Pred組血清鈣、磷水平顯著升高，血清ALP活性和TRAP活性升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與Pred組比較，Pred+ALN組和Pred+β-Ecd（10 mg/kg）組血清鈣、磷水平明顯降低，ALP和TRAP活性也顯著降低（P＜0.05）；Pred+β-Ecd（5 mg/kg）組，血清ALP和TRAP活性減低（P＜0.05），而鈣、磷水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖1。

2.2 骨結(jié)構和BMD Micro-CT檢測結(jié)果 在所有Pred處理組大鼠中均觀察到不同程度的骨丟失。在Pred組中第5腰椎的BMD值明顯低于對照組（P＜0.05）。Micro-CT評估顯示Pred組BS/TV較對照組顯著降低。三維模型分析顯示，Pred組Tb.N、BV/TV均明顯低于對照組，Tb.Sp明顯增加（P＜0.05），但Tb.Th和SMI差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與Pred組比，Pred+ALN組和Pred+β-Ecd（10 mg/kg）組BMD、BS/TV、BV/TV和Tb.N水平顯著增加，而Tb.Sp和SMI降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與Pred組比，Pred+β-Ecd（5 mg/kg）組BMD、BS/TV、BV/TV和Tb.N水平顯著增高，而Tb.Th和Tb.Sp水平降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1和圖2。

圖1 各組大鼠血清生化指標比較

表1 各組大鼠第5腰椎BMD及微結(jié)構參數(shù)比較（每組n=6， ±s）

圖2 各組大鼠第5腰椎CT三維重建圖像

3 討論

骨質(zhì)疏松癥的主要診斷評價標準包括BMD的測定和骨代謝生化指標檢測[6]。生物化學和生物力學研究表明，Pred誘導干預的大鼠BMD下降和骨小梁結(jié)構退化[7]。此外，ALP、TRAP、鈣、磷水平等生化指標的升高，提示骨吸收加重，成骨細胞活性下降，新生骨形成減少。近年來Pred誘導的骨質(zhì)疏松模型已成功用于許多關于糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥的實驗研究。研究[8-9]報道，Pred處理可降低骨礦物含量、皮質(zhì)厚度、應力/應變指數(shù)和組織BMD。在本研究中，我們成功建立了Pred誘導的骨質(zhì)疏松大鼠模型。

在血清骨代謝指標檢測結(jié)果中我們發(fā)現(xiàn)Pred使血清鈣、磷水平顯著升高，并提高了血清ALP活性和TRAP活性，證實Pred誘導干預后大鼠的骨吸收加重，成骨細胞活性下降，結(jié)果與相關研究報道相符[7]，也進一步表明本研究中大鼠實驗模型造模成功。但值得注意的是，在不同劑量的β-Ecd干預治療后，不僅均可抑制ALP和TRAP活性，且作用程度隨著劑量增加而增強。另一方面，隨著劑量的增加可顯著降低血清鈣、磷水平，提示骨吸收降低。

腰椎是BMD及微結(jié)構參數(shù)常用檢測部位[10]，研究表明，骨小梁結(jié)構是影響腰椎強度的關鍵因素[11]。動物解剖研究發(fā)現(xiàn)大鼠共6個椎體，其中第5、第6腰椎承受壓力最大，但第6腰椎因難以取材完整，故在BMD及微結(jié)構參數(shù)的實驗研究中一般都選擇第5腰椎來觀察。目前研究結(jié)果表明，BS/TV、BV/TV、Tb.N和Tb.Sp可能是早期檢測骨小梁結(jié)構改變的敏感變量，用于早期檢測骨小梁結(jié)構的改變，可預示骨質(zhì)疏松癥的發(fā)展。也有研究報道BMD與微結(jié)構參數(shù)相關[12]。本研究通過對大鼠第5腰椎進行Micro-CT檢測發(fā)現(xiàn)，在所有Pred處理的大鼠中均觀察到不同程度的骨丟失。BMD、BS/TV、Tb.N、BV/TV均明顯降低，且Tb.Sp增加顯著。但是通過不同劑量β-Ecd進行干預治療后，能顯著逆轉(zhuǎn)增加BMD、BS/TV、BV/TV和Tb.N水平，與ALN作用結(jié)果相似。進而提示，β-Ecd可使骨質(zhì)疏松性大鼠骨轉(zhuǎn)換率和BMD增高。

綜上所述，結(jié)合本研究結(jié)果表明，β-Ecd可能通過抑制骨丟失、改善骨代謝的作用機制，防治糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松癥。但本研究也存在不足之處，本研究結(jié)果僅為動物整體實驗數(shù)據(jù)，尚缺乏體外分子實驗。接下來本課題組將從骨組織細胞的活性分化及自噬、凋亡的角度，對糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松的分子生物學機制及β-Ecd的干預作用進行更進一步的研究。