金培峰，姜盛，翁家侃，2，王磊，丁露，趙凱翔，孫成超

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 心胸外科，浙江 溫州 325015；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院 心胸外科，浙江 杭州 310000；3.溫州醫(yī)科大學(xué) 機(jī)能中心，浙江 溫州 325035）

研究表明在心肌梗死（myocardial infarction，MI）后移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）能夠有效改善心功能[1-2]。由于MI部位的缺血缺氧，在細(xì)胞移植后的24 h后BMSCs的凋亡率達(dá)到了37.3%，使細(xì)胞移植的治療效果受到嚴(yán)重影響[1]，雖然通過基因轉(zhuǎn)染、添加生物因子能提高BMSCs的抗凋亡能力[3]，但存在潛在的致癌、細(xì)胞毒性的等缺點(diǎn)。因此尋找一種安全有效的提高BMSCs抗凋亡能力的方法，成為亟需解決的問題。

細(xì)胞膜微粒（microparticles，MPs）是細(xì)胞在激活或凋亡過程中從細(xì)胞膜上釋放的直徑0.1～1.0 μm的膜包裹的小囊泡，包含著原來細(xì)胞中所含的多種信號(hào)分子、膜脂類、細(xì)胞因子、miRNA、DNA、RNA、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，有廣泛的生物學(xué)功能[4]。如血液循環(huán)中的血小板MPs、內(nèi)皮細(xì)胞MPs，淋巴細(xì)胞MPs等在促進(jìn)血管新生、內(nèi)皮祖細(xì)胞的分化、抑制靶細(xì)胞的凋亡中起著非常重要的作用[5]。本研究利用MI后血液循環(huán)中的MPs來預(yù)處理BMSCs，提高BMSCs的抗凋亡能力，從而改善BMSCs移植治療MI的效果。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：32只雌性SD大鼠（體質(zhì)量200～220 g）用來制作MI模型；3只雄性SD大鼠（體質(zhì)量60～80 g）用來培養(yǎng)BMSCs。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均由溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物使用批準(zhǔn)號(hào)為SCXK（浙）2015-0001。

1.1.2 主要試劑：IMDM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司），胎牛血清（美國(guó)Gibco公司），AnnexinV/PI凋亡流式試劑盒（美國(guó)BD公司），胰酶（美國(guó)Sigma公司），厭氧產(chǎn)氣袋（日本三菱公司），AZD5363（上海碧云天公司），Evans blue（美國(guó)Sigma公司），Hoechst33258試劑盒（美國(guó)BD公司），Tunel檢測(cè)試劑盒（美國(guó)羅氏公司），PKH26（美國(guó)Sigma公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠MI模型制作：將雌性SD大鼠在水合氯醛麻醉下和小型動(dòng)物呼吸機(jī)輔助通氣下，左進(jìn)胸結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，制作大鼠MI模型[6]。

1.2.2 MI后血液MPs的提取和定量：在大鼠的MI模型建立后的24 h用水合氯醛對(duì)大鼠腹腔進(jìn)行注射麻醉后進(jìn)行全身肝素化。常規(guī)消毒鋪巾后，打開腹腔后于腹主動(dòng)脈取血，將采集到的血液在4 ℃的條件下，分別經(jīng)過不同轉(zhuǎn)速的梯度離心法去除血細(xì)胞、血小板、血漿，從而獲取血液中的MPs，最后將MPs用PBS重懸后分裝，并用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)[7]。為明確MI的面積，在大鼠處死后取出心臟，并用Evans blue生物染色劑對(duì)心臟進(jìn)行灌注染色。為明確所獲取的血液中MPs的濃度并用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)，將獲得的MPs使用BCA法來測(cè)定蛋白濃度，得出其濃度為（2.00±0.23）μg/mL，并將各個(gè)樣本的蛋白濃度統(tǒng)一調(diào)整至2 μg/mL用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 BMSCs的培養(yǎng)：體質(zhì)量60～80 g的大鼠處死后在無菌條件下分離大鼠的股骨和脛骨，以全骨髓貼壁法分離并培養(yǎng)BMSCs[8]，每間隔48 h換一次含10% FBS的IMDM培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%融合時(shí)，按照1∶2的比例傳代培養(yǎng)，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代BMSCs用于本實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.4 BMSCs對(duì)MPs的攝取作用：將獲取的MPs用PKH26進(jìn)行染色后，添加到生長(zhǎng)良好的第3代BMSCs的細(xì)胞爬片中共培養(yǎng)8 h，再將細(xì)胞爬片固定后，用DAPI對(duì)細(xì)胞核復(fù)染，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.5 細(xì)胞凋亡模型的建立和MPs的預(yù)處理：當(dāng)?shù)?代細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到70%～80%融合時(shí)用PBS沖洗2次，加入無血清的IMDM培養(yǎng)基及缺氧處理（置于密閉缺氧罐中，內(nèi)置耗氧劑），置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6 h。其中正常組（Control組）為完全培養(yǎng)基（IMDM+10% FBS）正常培養(yǎng)；BMSCs在進(jìn)行缺氧無血清處理前不添加MPs的為陽性對(duì)照組（Hypoxia/SD組）；將獲取MI后血液來源的MPs（濃度為2 μg/mL）來對(duì)BMSCs進(jìn)行預(yù)處理12 h，后再進(jìn)行缺氧無血清處理6 h作為MPs組，再利用Annexin V-FITC/PI染色進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。另外為明確不同濃度下的MPs對(duì)Hypoxia/SD條件下BMSCs的抗凋亡效果，分別按照正常濃度（2 μg/mL MPs組）、中等濃度（1 μg/mL MPs組）和低濃度（0.5 μg/mL MPs組）對(duì)BMSCs進(jìn)行預(yù)處理后再進(jìn)行Hypoxia/SD條件下的凋亡處理，并再利用Annexin V-FITC/PI染色進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.6 凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)檢測(cè)、Tunel和Westernblot檢測(cè)：將進(jìn)行缺氧和無血清處理后的細(xì)胞用PBS洗1次，然后加入含Hoechst33342的無血清DMEM培養(yǎng)基，Hoechst33342終濃度為0.1 g/L，室溫避光反應(yīng)10 min。用相差顯微鏡和熒光顯微鏡觀察，紫外光激發(fā)，觀察凋亡細(xì)胞并拍片。在凋亡細(xì)胞的

Tunel檢測(cè)中，將凋亡處理的BMSCs固定后，加50 μL Tunel反應(yīng)混合液，充分反應(yīng)后，再用DAB顯色液進(jìn)行顯色。最后按常規(guī)方法進(jìn)行蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化，自來水藍(lán)化，系列乙醇脫水，二甲苯透明，封片，顯微鏡下觀察。收集各組經(jīng)過凋亡處理的細(xì)胞，提取蛋白后，用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，并按20 μg每孔上樣，SDS-PAGE電泳，隨后將分離的蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，并經(jīng)過5%脫脂牛奶室溫封閉，分別經(jīng)過一抗和二抗的孵育，再次洗膜，ECL發(fā)光，膠片顯影、定影，每個(gè)樣本重復(fù)3次。用Quantity one軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白caspase-3和cleaved-caspase-3的灰度值和內(nèi)參β-actin的灰度值的比值代表其相對(duì)含量。相對(duì)灰度值=cleaved-caspase-3/caspase-3，表示cleavedcaspase-3相對(duì)含量高低，反應(yīng)凋亡情況。

1.2.7 細(xì)胞凋亡的相關(guān)信號(hào)通路檢測(cè)：為明確MPs抑制缺氧無血清誘導(dǎo)的BMSCs凋亡的機(jī)制，在信號(hào)通路研究中，在MPs預(yù)處理前1 h添加1.5 μL AKT信號(hào)通路阻斷劑AZD5363，經(jīng)過缺氧無血清凋亡處理后收集各組細(xì)胞，用Annexin V-FITC/PI染色進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用 ±s表示，2組間比較用t檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MI面積確定 左室前壁由于前降支的梗阻染色陰性，其MI面積為（37.63±2.06）%，達(dá)到本研究要求。

圖1 藍(lán)色未著色區(qū)域?yàn)楣Ｋ绤^(qū)域（Evans Blue染色）

2.2 BMSCs對(duì)MPs的攝取結(jié)果 在對(duì)BMSCs和MPs進(jìn)行共培養(yǎng)8 h后利用激光共聚焦顯微鏡觀察可見細(xì)胞質(zhì)內(nèi)充滿了點(diǎn)狀的紅染的MPs，見圖2。

圖2 BMSCs攝取經(jīng)PKH26染色的MPs的激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果（×200）

2.3 MPs對(duì)低氧無血清誘導(dǎo)BMSCs的凋亡抑制結(jié)果 BMSCs在經(jīng)過缺氧無血清誘導(dǎo)6 h后發(fā)生了細(xì)胞凋亡，其主要表現(xiàn)為細(xì)胞核的固縮、染色質(zhì)濃集、細(xì)胞變小；MPs能夠有效減少低氧無血清誘導(dǎo)BMSCs凋亡細(xì)胞的數(shù)量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖3。與MPs組比，Hypoxia/SD組cleavedcaspase 3表達(dá)量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖4。

2.4 AZD5363抑制MPs抗凋亡結(jié)果 與Hypoxia/SD組比，MPs能有效減少缺氧無血清環(huán)境誘導(dǎo)的凋亡，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與Hypoxia/SD組比，0.5 μg/mL MPs組也有顯著的抗凋亡作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），MPs的抗干細(xì)胞凋亡作用具有濃度依賴性；AZD+2 μg/mL MPs組的凋亡率顯著低于AZD組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖5。

3 討論

MI后MI部位缺血缺氧的微環(huán)境是導(dǎo)致移植的BMSCs凋亡的主要原因，從而使BMSCs移植治療MI的效果受到了很大的限制，因此如何安全而有效地抑制BMSCs在MI部位的凋亡，提高干細(xì)胞移植的治療效率，成為急需解決的問題。MPs可以利用所包涵的miRNA、蛋白等物質(zhì)介導(dǎo)信息傳遞，在組織修復(fù)、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等起著非常重要的作用[4]。MI后由于機(jī)體血流動(dòng)力學(xué)和內(nèi)環(huán)境的劇烈改變，機(jī)體產(chǎn)生的MPs會(huì)被釋放入血，導(dǎo)致外周血液中MPs會(huì)大量增加[9]，而且研究表明血液中MPs所包含的miRNA，如miR-133a、miR-21等，在促進(jìn)血管新生、內(nèi)皮祖細(xì)胞的分化、抑制靶細(xì)胞的凋亡中起著非常重要的作用[10]。因此在本研究中，我們利用MI后的血液中的MPs的這一特性來對(duì)BMSCs進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)其能有效抑制缺氧無血清誘導(dǎo)的BMSCs的凋亡，并且其抗凋亡的作用呈現(xiàn)濃度的相關(guān)性，在生理狀態(tài)濃度下，其抗凋亡效果最佳。

圖3 分別利用相差顯微鏡、Hoechst33342和Tunel染色的方法來觀測(cè)各組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化及凋亡細(xì)胞的陽性率

圖4 各組cleaved-caspase-3和caspase-3的表達(dá)及相對(duì)灰度值比較

圖5 不同濃度MPs抑制低氧無血清誘導(dǎo)的BMSCs的凋亡和AZD抑制MPs作用的流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果及凋亡細(xì)胞比例統(tǒng)計(jì)

由于MPs可以自體來源，并且在MI后MPs的量能夠顯著地增加，很好地解決免疫排斥和來源問題，相對(duì)于已有的基因轉(zhuǎn)染、添加生物因子來提高BMSCs生物學(xué)功能的方法可能存在的致癌、細(xì)胞毒性等缺點(diǎn)，MPs在生物安全性方面更加可靠。并且有研究表明MPs對(duì)于靶細(xì)胞的表觀改變是穩(wěn)定的[11-12]，因此MPs是能夠成為提高BMSCs抗凋亡能力而改善移植治療效率的理想因子。

Akt可以通過下游多種途徑對(duì)靶蛋白進(jìn)行磷酸化而發(fā)揮抗凋亡作用，其可以激活I(lǐng)κB激酶（IκKα），導(dǎo)致NF-κB的抑制劑IκB的降解，從而使NF-κB從細(xì)胞質(zhì)中釋放出來進(jìn)行核轉(zhuǎn)位，激活其靶基因而促進(jìn)細(xì)胞的存活。而AZD5363作為Akt信號(hào)通路的抑制劑，能夠有效抑制Akt的磷酸化，因此能阻斷Akt抗凋亡的信號(hào)通路作用。在本研究中AZD+2 μg/mL MPs組的凋亡率顯著低于單純AZD5363預(yù)處理后的AZD組，表明MI后血液中的MPs能夠有效抑制AZD5363的拮抗作用，表明MPs抑制BMSCs的凋亡作用可能主要通過激活A(yù)kt信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)的。

本研究表明MI后血液中提取的MPs能有效地抑制干細(xì)胞在缺氧無血清環(huán)境中的凋亡，為今后提高M(jìn)I后移植BMSCs的治療效果提供了新的思路。