黃 瑾，劉景雪，曾 穎

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200437；2.上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院藥劑科，上海 201299)

皮炎(dermatitis)是指由各種內(nèi)、外部感染或非感染性因素導(dǎo)致的皮膚炎癥，其病因和臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，且反復(fù)發(fā)作，臨床治療較為困難。以最常見的特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis，AD)為例，它是一種慢性的、反復(fù)發(fā)作的炎癥性皮膚病，常伴有劇烈瘙癢，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1-3]。隨著對(duì)AD免疫病理機(jī)制研究的不斷深入，治療AD的療法或藥物主要包括：免疫抑制劑環(huán)孢素A、霉酚酸酯、白三烯拮抗劑孟魯司特，針對(duì)CD11a、CD20、TNF-α或IgE的單克隆抗體，γ-干擾素以及靜脈注射免疫球蛋白等。上述藥物在臨床試用中均已顯示對(duì)AD具有一定療效，但由于副作用大或價(jià)格昂貴等原因使應(yīng)用受到限制。

近年來有文獻(xiàn)報(bào)道，中醫(yī)經(jīng)典方劑玉屏風(fēng)散對(duì)治療包括AD在內(nèi)的多種皮炎有確切效果[4-7]。玉屏風(fēng)散出自我國(guó)元代醫(yī)學(xué)家危亦林的中醫(yī)名著《世醫(yī)得效方》，由黃芪、白術(shù)、防風(fēng)三味中藥組成，臨床上將玉屏風(fēng)散作為中藥免疫調(diào)節(jié)劑加以使用。多糖組分是玉屏風(fēng)散發(fā)揮免疫干預(yù)作用的主要有效部位，能夠增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫和黏膜免疫功能。但多糖組分是否在玉屏風(fēng)散治療皮膚疾病中發(fā)揮主要作用，對(duì)在皮炎形成發(fā)展過程中有重要作用的皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞是否有免疫調(diào)節(jié)作用，目前尚未見報(bào)道。本研究分離提取了玉屏風(fēng)的多糖組分，探討其在體外對(duì)皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用，闡明玉屏風(fēng)多糖組分的活性作用，為其進(jìn)一步用于皮炎的臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與載體

人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocytes，KCs)株HaCaT細(xì)胞(中科院上海細(xì)胞所)，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.2 試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，胎牛血清(Hyclone公司)。LPS (E.coli ,O111∶B4 )、辣椒素(capsaicin，CAP，Sigma-Aldrich公司)；TNF-α(美國(guó)PeproTech公司)；聚角蛋白微絲蛋白(Filaggrin)的Elisa檢測(cè)試劑盒(武漢伊艾博科技有限公司)；IκBα、P65抗體及磷酸化抗體(Cell Signaling Technology，CST)。玉屏風(fēng)散由黃芪、白術(shù)、防風(fēng)三味中藥按3∶1∶1組成。實(shí)驗(yàn)中將玉屏風(fēng)組分進(jìn)行拆方研究，獲取黃芪多糖(APS)、白術(shù)多糖(PAM)、防風(fēng)多糖(SPS)、玉屏風(fēng)總水煎物(YPF)和玉屏風(fēng)總多糖(TP)，均由江蘇永健醫(yī)藥有限公司提供。

1.3 玉屏風(fēng)各組分對(duì)皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)炎

癥因子的影響

HaCaT細(xì)胞按常規(guī)培養(yǎng)并分入6孔板，培養(yǎng)過夜。加入YPF、APS、PAM、SPS及TP，終濃度均為200 μg/ml。處理30 min后，再加入終濃度為10 μg/ml的LPS培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，提取RNA，用Real-time PCR法檢測(cè)相關(guān)趨化分子和細(xì)胞炎癥因子mRNA表達(dá)水平，合成的引物序列見表1。

Real-time PCR實(shí)驗(yàn)條件設(shè)置如下，50℃：2 min，95℃：10 min；95℃：15 s，60℃：1 min，40個(gè)循環(huán)。樣品的半定量比較按以下公式計(jì)算：

ΔCt=目的基因Ct-GAPDH Ct。

表1 用于Real-time PCR的各引物序列

1.4 玉屏風(fēng)各組分對(duì)Filaggrin表達(dá)的影響

HaCaT細(xì)胞按常規(guī)培養(yǎng)并分入6孔板，加入各中藥組分處理30 min，再加入刺激劑辣椒素(capsaicin，CAP)10 μmol/L培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清液，提取RNA，分別采用Real-time PCR法檢測(cè)Filaggrin的mRNA(引物序列見表1)表達(dá)水平，用Elisa法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的蛋白表達(dá)水平。

1.5 玉屏風(fēng)各組分對(duì)炎癥相關(guān)信號(hào)通路NF-κB的影響

HaCaT細(xì)胞分別與YPF、APS及TP(200 μg/ml)預(yù)孵育2 h，用10 ng/ml的TNF-α刺激20 min，收集細(xì)胞，裂解蛋白。用Western blot檢測(cè)NF-κB通路中IκB的磷酸化及降解，以及P65的磷酸化水平，來表示這些組分對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB通路活化的影響。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用軟件SPSS 18進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，當(dāng)P<0.05時(shí)，認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 玉屏風(fēng)各組分的作用結(jié)果

2.1 抑制HaCaT細(xì)胞中炎癥因子mRNA表達(dá)水平

玉屏風(fēng)散多個(gè)組分均對(duì)LPS刺激的HaCaT細(xì)胞中炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-8和趨化分子MCP-1的表達(dá)有抑制作用(圖1)。其中APS、YPF和TP對(duì)炎癥細(xì)胞因子白介素(IL)-1β抑制率分別為36.2 %、47.7 %和49.3%；TP對(duì)IL-8和趨化分子MCP-1的抑制率最高，分別為105.5 %和61.7%，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

圖1 玉屏風(fēng)各組分對(duì)LPS刺激的HaCaT細(xì)胞中炎癥因子mRNA表達(dá)水平的影響(n=3) A.IL-1β相對(duì)表達(dá)量；B.IL-8相對(duì)表達(dá)量；C.MCP-1相對(duì)表達(dá)量

2.2 對(duì)Filaggrin表達(dá)的影響

Real-time PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(圖2A)，與CAP組比較，YPF、APS、PAM和TP對(duì)Filaggrin的mRNA表達(dá)均有促進(jìn)作用，可分別增加84.5%、33.1%、47.9%和67.6%。同時(shí)，Elisa實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖2B)表明，與CAP組比較，YPF、APS和TP對(duì)Filaggrin的蛋白表達(dá)均有促進(jìn)作用(P<0.05)，提示其對(duì)皮膚有較好的保護(hù)作用，而PAM組未表現(xiàn)出明顯差異。

圖2 玉屏風(fēng)各組分對(duì)KCs株HaCaT細(xì)胞中Filaggrin表達(dá)的影響(n=3) A.Real-time PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果；B.Elisa實(shí)驗(yàn)結(jié)果*P<0.05，與空白組比較；#P<0.05，與CAP組比較

2.3 對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響

NF-κB信號(hào)通路是炎癥和免疫細(xì)胞的共同活化通路。在前期工作的基礎(chǔ)上，選擇YPF、APS和TP(200 μg/ml)，檢測(cè)其對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB通路的影響。NF-κB常見的形式是由p50和p65蛋白亞基組成異源二聚體，在靜息狀態(tài)時(shí)與其抑制物IκB結(jié)合以無活性的復(fù)合物形式存在于細(xì)胞漿，當(dāng)細(xì)胞受到外來刺激時(shí)，通過一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，激活系列激酶使IκB降解從而釋放NF-κB，使其從細(xì)胞漿移位到細(xì)胞核，并在胞核內(nèi)與相應(yīng)基因上的結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生特異性的結(jié)合，調(diào)控炎癥細(xì)胞因子、趨化因子、黏附分子等相關(guān)基因的表達(dá)，參與調(diào)控機(jī)體的免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)。Western blot結(jié)果表明(圖3)，YPF、APS和TP 3種組分均具有顯著抑制HaCaT細(xì)胞中NF-κB通路活化的作用，其中以TP作用最強(qiáng)。

圖3 玉屏風(fēng)各組分對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞中NF-κB通路活化的影響

3 討論

AD表現(xiàn)為明顯的濕疹樣變和皮膚干燥，病程遷延難愈，易反復(fù)發(fā)作，瘙癢難忍，常影響情緒和睡眠，被醫(yī)學(xué)界視為“濕疹中最難治的一種”。AD是一種雙相型T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病，而KCs、朗格罕氏細(xì)胞(Langerhans cells，LCs)和炎癥性表皮樹突狀細(xì)胞(inflammatory dendritic epidermal cells，IDECs)在炎癥因子分泌和抗原遞呈激活T細(xì)胞的過程中發(fā)揮重要作用。KCs既是皮膚屏障功能的重要執(zhí)行者，也是免疫應(yīng)答的積極參與者，其生物學(xué)功能以往被大大低估。KCs還是各種趨化因子和細(xì)胞因子的重要分泌細(xì)胞，進(jìn)一步研究其免疫功能將有助于對(duì)AD發(fā)病機(jī)制的理解和開發(fā)新的治療策略。

AD的藥物研發(fā)一直受到廣泛關(guān)注。傳統(tǒng)治療方法(使用激素、抗組胺藥、抗炎藥等)可以暫時(shí)緩解癥狀，但停藥后往往復(fù)發(fā)，且病情加重，甚至轉(zhuǎn)為慢性。外用糖皮質(zhì)激素由于作用迅速且療效顯著，常用于AD治療。然而這類藥物長(zhǎng)期外用可能引起皮膚萎縮、毛細(xì)血管擴(kuò)張、色素沉著、口周皮炎以及繼發(fā)感染等不良反應(yīng)。玉屏風(fēng)散方中黃芪益氣固表止汗為君；白術(shù)補(bǔ)氣健脾為臣；佐以防風(fēng)走表而散風(fēng)邪，合黃芪、白術(shù)以益氣祛邪。且黃芪得防風(fēng)，固表而不致留邪；防風(fēng)得黃芪，祛邪而不傷正，有補(bǔ)中寓疏，散中寓補(bǔ)之意。黃芪中含有多糖、蛋白質(zhì)、生物堿、氨基酸、黃酮類、微量元素等活性物質(zhì)，其中多糖成分的免疫活性最為突出[8]。APS從黃芪中提煉得到，是黃芪的主要生物活性成分。早在20世紀(jì)90年代，有日本學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖具有增強(qiáng)老齡鼠產(chǎn)生抗體的作用[9]。PAM作為白術(shù)的一個(gè)重要組成成分，具有毒性小、生物利用度高、藥理作用明確等特點(diǎn)[10]，已經(jīng)用于食品添加劑，并作為臨床藥物用于恢復(fù)期腫瘤患者或在化療時(shí)輔助應(yīng)用，目前已經(jīng)證明其有明顯的增強(qiáng)免疫作用。防風(fēng)亦具有增強(qiáng)免疫作用，其有效部位為多糖，SPS具有增強(qiáng)免疫活性，能明顯增加體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞釋放IL-1和IL-8，提高NK細(xì)胞和脾淋巴細(xì)胞的殺傷活性，促進(jìn)IL-2對(duì)NK細(xì)胞的激活[11]；還有研究表明SPS呈劑量依賴性地提高小鼠特異性免疫和細(xì)胞免疫功能，還能促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖。

由KCs分泌的一種被稱為Filaggrin的分子是構(gòu)成皮膚屏障功能的重要成分[12]。AD患者皮膚Filaggrin表達(dá)減少是導(dǎo)致皮膚屏障功能缺陷的重要原因，而皮膚屏障功能缺陷則使環(huán)境中的蛋白抗原、微生物和其他刺激原易于通過表皮層，進(jìn)而刺激局部免疫細(xì)胞，觸發(fā)Ⅰ型和Ⅳ型變態(tài)反應(yīng)，這是啟動(dòng)皮膚炎癥的主要環(huán)節(jié)。為了進(jìn)一步考察玉屏風(fēng)各組分對(duì)皮膚的保護(hù)作用，筆者驗(yàn)證了其對(duì)Filaggrin表達(dá)的影響(該蛋白表達(dá)上調(diào)可能促進(jìn)真皮屏障功能的恢復(fù))。

筆者對(duì)玉屏風(fēng)散的多糖組分對(duì)皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)APS和TP都有明顯的免疫調(diào)節(jié)作用，以后者的作用更為顯著。TP可以抑制激活的皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞分泌炎癥介質(zhì)，促進(jìn)Filaggrin的表達(dá)，并對(duì)炎癥和免疫細(xì)胞的活化具有重要作用的NF-κB信號(hào)通路有明顯的抑制作用。這些基礎(chǔ)研究為進(jìn)一步開發(fā)利用中藥方劑玉屏風(fēng)用于AD的治療闡明了作用機(jī)制，打下了良好的基礎(chǔ)。