常瑞蕊，陳衛(wèi)東，周婷婷

(1.安徽中醫(yī)藥大學藥學院，安徽 合肥 233000；2.海軍軍醫(yī)大學藥學院藥物分析教研室，上海 200433)

梔子是茜草科植物梔子(GardeniajasminoidesEllis)的干燥成熟果實,具有瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒以及消腫止痛的功效[1]，臨床上常用于糖尿病、抑郁癥、高脂血癥、炎癥及絕經(jīng)后綜合征[2-4]。梔子中主要含有環(huán)烯醚萜苷類、有機酸酯、黃酮類以及二萜色素等成分[5]。其中，環(huán)烯醚萜苷類化合物為主要成分，該類成分具有利膽、保肝、抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理活性[6]。

目前，梔子的質(zhì)量控制多采用高效液相色譜法[7]、超高效液相色譜法[8]或者高效薄層色譜法[9]等對梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、山梔苷等環(huán)烯醚萜苷類成分進行定量分析，但是上述方法均存在分析時間長、靈敏度和分辨度低等缺點。液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)是一種液相色譜與質(zhì)譜串聯(lián)的技術，其將液相的高分離效能與質(zhì)譜的強結構測定功能相結合[10]，其中，串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)具有更高的靈敏度和更強的選擇性。因此，本研究采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法同時測定梔子中3種環(huán)烯醚萜苷類成分：山梔苷、梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷的含量，不僅能縮短分析時間、提高分析效率，而且利用質(zhì)譜的高分辨率和高靈敏度，對梔子中含量較少的山梔苷進行準確定量，為梔子質(zhì)量控制提供更全面的依據(jù)。

1 儀器與試藥

Shinmadzu 8040島津液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(日本島津公司)，包括兩臺LC-30A色譜泵，SIL-30AC自動進樣器，CTO-30A柱溫箱，CBM-20A系統(tǒng)控制器和一臺8040三重四級桿質(zhì)譜儀；CR3i高速冷凍離心機(美國賽默飛公司)；XS205精密天平(梅特勒-托利多國際有限公司)。

梔子藥材(上海童涵春堂中藥飲片有限公司，產(chǎn)地：江西)。對照標準品山梔苷(批號：17090822，上海同田生物技術股份有限公司)，京尼平龍膽雙糖苷(批號：M0502AS，大連美侖生物技術有限公司)，梔子苷(批號：G1910050，上海安譜實驗科技股份有限公司，純度≥98%)；色譜純乙腈(美國Honeywell公司)，乙酸(美國Tedia公司)；超純水通過Milli-Q系統(tǒng)在實驗室自制。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

Dikma Diamonsil?C18色譜柱(100 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相：0.1%乙酸水(A)-0.1%乙酸乙腈(B)。梯度洗脫程序：0～1 min，22%～35% B；1～4 min，35% B；4～5 min,35%～22% B。流速0.4 ml/min，柱溫40 ℃，進樣體積2 μl，分析時間5 min。結果見圖1。

2.2 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧電離源(ESI)，正/負離子檢測，掃描方式為多重反應監(jiān)測模式(MRM)。正離子檢測模式下，京尼平龍膽雙糖苷m/z573.40→365.05，碰撞電壓：-34 eV；負離子檢測模式下，山梔苷m/z391.10→149.30，碰撞電壓：28 eV；梔子苷m/z447.30→225.15，碰撞電壓：14 eV。霧化氣流量3 L/min，干燥氣流量15 L/min，脫溶劑管溫度 240 ℃，加熱塊溫度400 ℃，碰撞氣壓力230 kPa。結果見圖2。

2.3對照品溶液的制備

分別精密稱取山梔苷5.38 mg、京尼平龍膽雙糖苷5.16 mg、梔子苷2.50 mg，用初始流動相定容至5 ml容量瓶中，搖勻，分別得到濃度為1.08、1.03和0.50 mg/ml的混合對照品溶液。

2.4 供試品溶液的制備

精密稱取梔子藥材粉末0.5 g，用50%乙腈定容至10 ml容量瓶中，搖勻，將粗提物以12 000 r/min離心10 min，取上清液，過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，精密吸取續(xù)濾液100 μl，用50%乙腈定容至100 ml容量瓶中，得梔子供試品溶液，備用。

2.5 標準曲線的繪制

精密吸取“2.3”項下混和對照品溶液，分別逐級稀釋，按照“2.1”、“2.2”項下條件，進樣2 μl，記錄各對照品的濃度。以各對照品的質(zhì)量濃度(X，ng/ml)為橫坐標，峰面積值(Y)為縱坐標，進行線性回歸，得標準曲線方程，山梔苷：Y= 243.810X-289.957，r=0.999 9，線性范圍10.76～215.2 ng/ml；京尼平龍膽雙糖苷：Y= 137.125X+2 092.76，r=0.999 6，線性范圍516～4 128 ng/ml；梔子苷：Y= 2 030.32X+823 213，r=0.999 8，線性范圍2 000～20 000 ng/ml。以上結果表明，山梔苷、京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷在相應的濃度范圍內(nèi)線性關系良好。

2.6 精密度試驗

精密吸取山梔苷、京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷濃度分別為53.8、2 064、10 000 ng/ml的混合對照品溶液。按“2.1”、“2.2”項下條件，于同一天重復進樣6次，記錄峰面積。結果顯示山梔苷、京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷峰面積的RSD分別為1.33%、0.93%和1.06%，表明該方法精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取供試品溶液(編號：20180627)，于室溫下分別放置0、2、4、6、8 h后，按“2.1”、“2.2”項下條件進樣分析，記錄峰面積，結果顯示，山梔苷、京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷峰面積的RSD分別為1.74%、1.09%和0.59%，表明供試品溶液在室溫條件下穩(wěn)定。

2.8 重復性試驗

分別精密稱取同一批藥材粉末0.5 g(編號：20180627,山梔苷、京尼平龍膽雙糖苷和梔子苷的含量分別為0.06%、3.76%、12.45%)，按“2.4”項下處理后，按照“2.1”、“2.2”項下條件測定，記錄峰面積，平行實驗5次，結果顯示，山梔苷、京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷峰面積的RSD依次為1.36%、1.44%、1.88%，表明該方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗

精密稱取6份已知含量的梔子藥材粉末0.5 g(編號：20180627)，按“2.4”項下處理后，按各成分在原藥材中的含量，分別精密加入相同含量和濃度的混合對照品溶液，按“2.1”、“2.2”項下條件進行分析，測定回收率。結果見表1。

2.10 樣品含量測定

分別稱取3批不同批次的梔子樣品粉末，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”、“2.2”項下條件測定，每份溶液進樣3次，計算山梔苷、京尼平龍膽雙糖苷和梔子苷的含量。結果見表2。

圖1 3種待測物的MRM色譜圖 A.空白乙腈溶劑；B. 3種待測物混合對照品；C.梔子粉末樣品1.山梔苷；2.京尼平龍膽雙糖苷；3.梔子苷

圖2 3種待測物的產(chǎn)物離子質(zhì)譜圖 A.山梔苷；B.京尼平龍膽雙糖苷；C.梔子苷

化合物樣品量(m/g)原有量(m/mg)加入量(m/mg)測得量(m/mg)平均回收率(%)RSD(%)山梔苷0.500 90.360.400.78103.731.770.500 40.370.400.760.500 20.380.400.770.500 50.400.400.810.500 00.390.400.790.500 40.420.400.82京尼平0.500 920.8620.0042.18102.021.40龍膽雙0.500 421.7520.0042.07糖苷0.500 219.7020.0039.990.500 520.0720.0041.810.500021.7920.0041.030.500 422.2220.0040.88梔子苷0.500 969.1465.00135.80102.961.050.500 465.8565.00134.520.500 266.7965.00134.730.500 565.7465.00135.910.500 065.6965.00133.680.500 967.2365.00134.56

表2 不同批次梔子中3種環(huán)烯醚萜苷類成分的含量

3 討論

3.1 檢測離子的選擇

目前，在國內(nèi)外關于環(huán)烯醚萜苷類成分的質(zhì)譜檢測條件的報道中，一級質(zhì)譜多以負離子模式下的[M-H]-為主[11-12]。由于不同儀器的響應和靈敏度不同，本實驗采用負離子模式對山梔苷和梔子苷進行檢測，采用正離子模式對京尼平龍膽雙糖苷進行檢測。對于一級質(zhì)譜碎片離子的選擇，山梔苷為[M-H]-，梔子苷為[M+CH3COO]-，京尼平龍膽雙糖苷為[M+Na]+。在二級質(zhì)譜中，山梔苷的碎片離子選擇[M-H-O-Glu-COOH]-，梔子苷的碎片離子選擇[M+CH3COO-Glu-C2H2-OH]-，京尼平龍膽雙糖苷的碎片離子選擇[M+Na-Glu-CO]+。先前報道表明環(huán)烯醚萜苷類成分在二級質(zhì)譜中糖基易斷裂[13-14]，本實驗結果與報道相符。

3.2 色譜條件的選擇

本實驗分別考察了乙腈和甲醇作為流動相中的有機相，發(fā)現(xiàn)乙腈作為有機相時，色譜分離效果更好，質(zhì)譜響應強度更高，為了增強響應值、縮短分離時間，選擇乙腈作為流動相中的有機相。同時本實驗比較了流動相中添加0.1%甲酸和0.1%乙酸對離子化響應度和分離效果的影響，結果發(fā)現(xiàn)流動相中添加0.1%乙酸的離子化響應度以及分離效果更好，故選擇0.1%乙酸水-0.1%乙酸乙腈作為流動相。

本實驗對LC-MS/MS測定梔子中3種環(huán)烯醚萜苷類成分的方法進行了驗證。結果表明，該方法具有較寬的線性范圍，并且3種物質(zhì)在此范圍內(nèi)具有良好的線性關系和相關系數(shù)(r>0.999)；與此同時，精密度、穩(wěn)定性、重復性和回收率的RSD均<2%，符合分析方法的要求。以上方法學考察數(shù)據(jù)顯示，本實驗建立的方法靈敏可靠，可用于測定梔子中3種環(huán)烯醚萜苷類成分的含量。