黃 萃，劉林峰，張祥華，鄧賢才，鄔向東*

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寵物犬布魯氏菌的分離與16S rDNA序列鑒定

黃 萃1，劉林峰2，張祥華2，鄧賢才2，鄔向東1*

（1. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西 南昌 330045；2. 栢特佳寵獸醫(yī)院，江西 南昌 330013）

從某疑似感染布魯氏菌寵物犬全血中分離到一株細(xì)菌，對(duì)其進(jìn)行純化培養(yǎng)、染色鏡檢，PCR擴(kuò)增其16S rDNA基因片段，將擴(kuò)增的產(chǎn)物純化后測(cè)序，用NCBI軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性檢索，結(jié)果顯示其與布魯氏菌同源性達(dá)到100%；應(yīng)用DNAStar軟件進(jìn)行16S rDNA序列相似性分析，結(jié)果分離菌株與布魯氏菌16S rDNA核苷酸序列相似性達(dá)99.6%～100%，表明分離菌株為布魯氏菌。其分離菌株是犬種還是牛、羊種布魯氏菌還需要進(jìn)一步研究。

寵物犬；布魯氏菌；16S rDNA

布魯氏菌病(簡稱“布病”)是由布魯氏菌引起的一種人畜共患傳染病，是一種嚴(yán)重的慢性變態(tài)反應(yīng)性傳染病[1]。布魯氏菌是兼性胞內(nèi)寄生的革蘭氏陰性球桿菌，無芽胞，無鞭毛，不運(yùn)動(dòng)，具有強(qiáng)烈的致病性；對(duì)營養(yǎng)需求高，生長最適溫度為37 ℃[2-3]。其根據(jù)抗原性和主要宿主分為9個(gè)種，21個(gè)型：豬布魯氏菌（5個(gè)生物型：1、2、3、4、5）、牛布魯氏菌（7個(gè)生物型：1、2、3、4、5、6、9）、羊布魯氏菌（3個(gè)生物型：1、2、3）、綿羊附睪布魯氏菌、犬布魯氏菌、沙林鼠布魯氏菌、鰭布魯氏菌、鯨布魯氏菌和田鼠布魯氏菌[4-5]。

羊、牛、豬種布魯氏菌屬于光滑型布魯氏菌，均可感染人；犬種布魯氏菌屬于粗糙型菌株，主要感染犬類動(dòng)物，臨床上可引起母犬流產(chǎn)或不孕、公犬附睪炎等[5, 6]。豬、牛、羊布魯氏菌也可感染犬，且多為隱性感染，1931年首次報(bào)道了豬布魯氏菌感染犬的病例[7]。豬、牛、羊布魯氏菌毒力強(qiáng)，感染犬后可作為傳染源傳染給人，而犬與人接觸密切，因此對(duì)人類危害更大[8]。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人們生活水平的提高，人們飼養(yǎng)犬的數(shù)量逐年增多，從而人們與犬的接觸越來越密切，導(dǎo)致犬布魯氏菌病的發(fā)病數(shù)量和受感染人群逐年遞增，該病對(duì)人類健康和公共衛(wèi)生安全所帶來的危害也日趨嚴(yán)重，應(yīng)加大對(duì)其的研究與防治[9, 10]。

本試驗(yàn)對(duì)從寵物犬全血中分離到的一株疑似布魯氏菌(命名為sp JX)進(jìn)行純化培養(yǎng)、染色鏡檢，采用PCR擴(kuò)增其16S rDNA基因片段并進(jìn)行測(cè)序，用NCBI軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性檢索，并用DNAStar軟件進(jìn)行16S rDNA序列相似性分析，最終確定該菌株為布魯氏菌。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 病料及來源 來自于就診江西農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)院的某疑似感染布魯氏菌病的發(fā)病犬，從全血中分離得到該菌。

1.1.2 主要培養(yǎng)基及試劑 血瓊脂培養(yǎng)基，由本實(shí)驗(yàn)室自制；PCR Mix、100 bp DNA Ladder，購自北京全式金生物科技有限公司；飽和酚、溴化乙錠（EB），購自上海生工生物工程股份有限公司；膠回收試劑盒，購自O(shè)mega公司；Tris堿，購自Solarbio公司；SDS、Agarose，購自Sigma公司。

1.1.3 主要設(shè)備 凈化工作臺(tái)(型號(hào)為SW-CJ)，購自蘇州凈化設(shè)備有限公司；立式壓力蒸氣滅菌器(型號(hào)為YXQ-LS-75S11)、生化培養(yǎng)箱(型號(hào)為SPX-150B-Z)，購自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；冷凍臺(tái)式高速離心機(jī)(型號(hào)為5415R)，購自Eppendorf公司；PCR儀(型號(hào)為K960)，購自杭州晶格儀器有限公司。

1.1.4 引物設(shè)計(jì) 分離株的16S rDNA基因序列的擴(kuò)增采用細(xì)菌16S rDNA通用引物，由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列如下：

16S(F)5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′，

16S(R)5′GGTTACCTTGTTACGACTT3′。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離 無菌取發(fā)病犬的全血涂布于血瓊脂培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基置于燭缸內(nèi)，在37 ℃溫箱中培養(yǎng)5~7 d后進(jìn)行觀察，挑取可疑單個(gè)菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)。

1.2.2 染色鏡檢 分別勾取純化培養(yǎng)的單個(gè)菌落進(jìn)行涂片，經(jīng)革蘭氏染色和柯茲洛夫斯基染色，油鏡鏡檢，觀察記錄其形態(tài)特征。

1.2.3 細(xì)菌16SrDNA鑒定 （1）細(xì)菌DNA提取。取1.5 mL規(guī)格離心管，加入無菌雙蒸水100 μL，勾取上述純化培養(yǎng)的菌落2接種環(huán)于離心管中，95~100 ℃煮沸10 min；12 000 r/min離心5 min，取上清，作為細(xì)菌DNA模板，-20 ℃保存?zhèn)溆肹11]。

（2）細(xì)菌16SrDNA的PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：總體積為25 μL，其中含16S(F)和16S(R)各1 μL、PCR Mix 12.5 μL、DNA模板1 μL以及ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，30 min后在紫外燈下觀察結(jié)果，并拍照記錄。

（3）16S rDNA測(cè)序與序列分析。用膠回收試劑盒回收目的片段，將純化回收的目的片段送至南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。運(yùn)用NCBI基因庫中的BLAST對(duì)分離株測(cè)序所得序列進(jìn)行同源性檢索和分析對(duì)比，并用DNAStar對(duì)分離株和NCBI上布魯氏菌菌株16S rDNA基因序列進(jìn)行相似性比對(duì)分析。相似性>99%定義為種，相似性在95%~99%則定義為屬，相似性<95%則定義為科[12]。

2 結(jié) 果

2.1 染色鏡檢結(jié)果

結(jié)果表明，分離株經(jīng)柯茲洛夫斯基染色為紅色短桿狀（圖1），革蘭氏染色為革蘭氏陰性球桿菌（圖2），初步懷疑其為布魯氏菌。

2.2 細(xì)菌16S rDNA基因擴(kuò)增結(jié)果

PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖3，可見有一條清晰的DNA條帶，大小約1 500 bp，與預(yù)期大小相符。

圖1 柯茲洛夫斯基染色結(jié)果（10×100）

圖2 革蘭氏染色結(jié)果（10×100）

a為100 bp Marker，b為細(xì)菌16S rDNA

2.3 序列分析

分離株. sp JX測(cè)序所得目的序列大小為1 335 bp，與預(yù)期大小相符。. sp JX基因序列與NCBI基因庫中的布魯氏菌16S rDNA基因序列進(jìn)行同源性分析對(duì)比，顯示該序列與布魯氏菌同源性達(dá)100%；用DNAStar對(duì)分離株. sp JX和NCBI上布魯氏菌菌株16S rDNA基因序列進(jìn)行相似性比對(duì)分析，結(jié)果顯示與已知布魯氏菌菌株16S rDNA基因序列相似性達(dá)99.6%~100%（圖4）。

參考菌株為：羊布魯氏菌（B. ovis）、流產(chǎn)布魯氏菌（B. abortus）、豬布魯氏菌（B. suis）、馬爾他布魯氏菌（B. melitensis）、犬布魯氏菌（B. canis）、田鼠布魯氏菌（B. microti）、紅布魯氏菌（B. inopinata）、帕皮布魯氏菌（Brucella.）、狐貍布魯氏菌（B. vulpis）

3 小結(jié)與討論

布病常用檢測(cè)方法主要包括細(xì)菌學(xué)和免疫學(xué)。傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)檢測(cè)技術(shù)準(zhǔn)確可靠，但操作繁瑣，時(shí)間較長，且存在較大的實(shí)驗(yàn)室生物安全隱患[13]。核酸序列分析技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，其中，16S rDNA序列分析技術(shù)已成為鑒定細(xì)菌種屬的重要方法[14]。本試驗(yàn)運(yùn)用16S rDNA序列同源性分析對(duì)疑似感染布魯氏菌寵物犬進(jìn)行了鑒定，確診了寵物犬感染布魯氏菌的病例，結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了16S rDNA序列同源性分析技術(shù)鑒定布魯氏菌的準(zhǔn)確性和可行性。

但是單純的16S rDNA序列分析也有其缺點(diǎn)，上述通過對(duì)分離株. sp JX與各布魯氏菌菌株16S rDNA基因序列進(jìn)行相似性比對(duì)分析表明，單純的16S rDNA序列分析不能對(duì)布魯氏菌進(jìn)行種和基因分型鑒定，因此需要進(jìn)一步通過多重PCR、AMOS-PCR、Rep-PCR、MLST、MLVA技術(shù)[15]等方法對(duì)布魯氏菌屬做進(jìn)一步種型鑒定。

布魯氏菌病是世界性的人畜共患慢性傳染病。目前，全球多個(gè)國家和地區(qū)仍廣泛流行犬布魯氏菌病[16]，且發(fā)病數(shù)量和受感染人群呈逐年上升趨勢(shì)。犬種布魯氏菌主要感染犬，豬、牛、羊以及人類對(duì)犬種布魯氏桿菌易感性低。但犬可感染豬、牛、羊種布魯氏菌，所以人類感染布魯氏菌病的主要傳播途徑可能是接觸了感染豬、牛、羊種布魯氏菌的犬，且豬、牛、羊種布魯氏菌毒力強(qiáng)，因此給人帶來的危害更大。本次從流產(chǎn)犬中分離到布魯氏菌提供了參考，但仍不能確定是牛、羊種或犬種布魯氏菌，還需送檢到微生物三級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。

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Isolation of Brucella on Pet Dogs as well as Its 16S rDNA Sequence Identification

HUANG Cui1, LIU Lin-feng2, ZHANG Xiong-hua2, DENG Xian-cai2, WU Xiang-dong1*

(1. School of Animal Science and Technology, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China; 2. Partridge Veterinary Hospital, Nanchang 330013, China)

A strain of bacteria from the whole blood of a suspected Brucella-infected pet dog was isolated, purified, stained and microscopically examined, and the 16SrDNA gene fragment was amplified by PCR. The amplified product was purified and sequenced, and then NCBI software was used. The results showed that its homology with Brucella reached 100%; 16SrDNA sequence similarity analysis was performed by using DNAStar software, and it was found that the nucleotide sequence similarity between the isolated strain and Brucella 16S rDNA was between 99.6% and 100%, indicating that the isolated strain was Brucella, but whether the isolated strain wasorremains to be further studied.

pet dog; Brucella; 16SrDNA

S829.2

A

2095-3704（2018）04-0290-04

2018-11-01

2018-12-04

黃萃（1995—），女，碩士，主要從事動(dòng)物病原及免疫學(xué)，1415365418@qq.com；

鄔向東，副教授，dxywxd2006@126.com。

10.3969/j.issn.2095-3704.2018.04.60

黃萃, 劉林峰, 張祥華, 等. 寵物犬布魯氏菌的分離與16S rDNA序列鑒定[J]. 生物災(zāi)害科學(xué), 2018, 41(4): 290-293.