陳言柳，裴男才，吳 斐，張 揚，郭春蘭，張林平*，李子林

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不同地區(qū)油茶內(nèi)生真菌多樣性及其抑菌活性

陳言柳1，裴男才2，吳 斐1，張 揚1，郭春蘭1，張林平1*，李子林3

（1. 江西農(nóng)業(yè)大學 鄱陽湖流域森林生態(tài)系統(tǒng)保護與修復(fù)國家林業(yè)局重點實驗室，江西 南昌 330045；2. 中國林業(yè)科學研究院 熱帶林業(yè)研究所，廣東 廣州 510520；3. 九連山國家級自然保護區(qū)管理局，江西 龍南 341702）

以江西、湖南、福建3個地區(qū)的油茶不同組織為材料，通過組織分離法分離其內(nèi)生真菌并進行多樣性分析和抑菌性分析。結(jié)果表明，共分離出352株內(nèi)生真菌，隸屬34屬56種，其中子囊菌46種（86.65％），擔子菌10種（13.35％）。球座菌屬（）、擬莖點屬（）、炭疽菌屬（）以及鏈格孢屬（）為優(yōu)勢屬，分別占總株數(shù)的17.33%、16.19%、13.35%以及6.25%。從分離部位上看，葉片中的內(nèi)生真菌分離率和定殖率最高，分別為71.11%和73.89%，而樹皮中的內(nèi)生真菌擁有最高的多樣性指數(shù)；從采樣地點上看，江西油茶內(nèi)生真菌的分離率和定殖率最高，其次是湖南和福建。抑菌性結(jié)果顯示，共有26種（46.43％）內(nèi)生真菌具有抑菌活性，其中3株內(nèi)生真菌（CF108，CF100，CF65）對所選的病原菌具有較強的抑制活性，表明這3株內(nèi)生真菌具有較好的應(yīng)用潛能。

油茶；內(nèi)生真菌；多樣性；抑菌活性

油茶（Abel）系常綠小喬木或灌木，是我國亞熱帶地區(qū)特有的木本食用油料樹種[1]。油茶的工業(yè)價值、旅游文化價值、生態(tài)價值、食用價值等市場經(jīng)濟價值是不可估量的[2]。但是，隨著油茶大面積種植和集約化生產(chǎn)的發(fā)展，加之油茶高產(chǎn)優(yōu)良無性系推廣，油茶病害的發(fā)生程度突顯嚴重，成為當前我國油茶生產(chǎn)的主要矛盾，嚴重制約了油茶產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[3]。內(nèi)生真菌是指一直生活在植物體內(nèi)或其生活史的一定階段處于植物體內(nèi)并對寄主植物不形成明顯病癥的真菌[4]。大量研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生真菌能夠與寄主植物形成共生關(guān)系，對宿主的生長有促進作用，并生產(chǎn)與寄主植物相同或相似的活性次生代謝產(chǎn)物[5-7]，有抗菌、抗腫瘤、殺蟲、免疫抑制、抗氧化等生物活性[8-10]。

本課題組前期證實油茶中具有豐富的內(nèi)生真菌資源，但未對內(nèi)生真菌的應(yīng)用潛能進行研究。因此，本研究以江西南昌、湖南長沙、福建羅源的油茶為材料進行內(nèi)生真菌分離鑒定，探討油茶內(nèi)生真菌的地理差異與分布，并進行內(nèi)生真菌抑菌活性篩選，為進一步開發(fā)利用油茶內(nèi)生真菌資源提供理論依據(jù)。

1 材 料

1.1 供試樣品

供試樣品于2016年9月分別從江西南昌、湖南長沙和福建羅源三地隨機選取3株新鮮健康的油茶植株（表1），采集其葉片、莖、樹皮和果實，取樣后迅速分裝于無菌密封袋中密封保濕，并于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 三個采集點的地理位置及特征

1.2 抑菌實驗指示菌

本試驗共選取了7種病原菌作為指示菌，其中4種病菌真菌，3種病原細菌。

病原真菌：膠孢炭疽菌（A）：辣椒疫霉病菌（B）：水稻紋枯病菌（C）：、茄枯萎病病菌（D）：。

病原細菌：大腸桿菌（E）：金黃色葡萄球菌（F）：、枯草芽孢桿菌（G）：。上述病原指示菌均保存于鄱陽湖流域森林生態(tài)系統(tǒng)保護與修復(fù)實驗室（江西農(nóng)業(yè)大學）。

2 方 法

2.1 油茶內(nèi)生真菌的分離與純化

取新鮮健康的油茶葉、莖、樹皮和果實用清水洗凈后進行表面消毒。植物組織塊的表面消毒按下列步驟進行：將組織材料放入體積分數(shù)為75%乙醇中浸泡1 min，無菌水沖洗3~4次，緊接著用2.5%次氯酸鈉溶液浸泡3 min，再用無菌水沖洗3~4次后放入干燥的無菌濾紙上。吸干后用無菌剪刀將葉、皮剪成5 mm×5 mm的小片、枝條切成5 mm長的小段、果剪成5 mm ×5 mm ×5 mm小塊。上述組織塊分別置于PDA平板中，每皿5塊，設(shè)置3個重復(fù)，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)4~5 d，觀察材料切口處菌絲有無及生長情況。為確保材料徹底消毒，以最后一次沖洗的無菌水作為對照。若對照組培養(yǎng)基未長出菌絲，說明表面消毒徹底。待切口處長出菌絲后，采用尖端菌絲挑取法轉(zhuǎn)接至新鮮無菌的PDA培養(yǎng)基中純化。純化后再轉(zhuǎn)接到PDA斜面試管中，置于4 ℃冰柜保存[11]。

2.2 內(nèi)生真菌的鑒定

采用形態(tài)和分子相結(jié)合的方法對菌株進行鑒定，對產(chǎn)孢的菌株觀察其孢子的大小、形狀、顏色和產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等形態(tài)特征，依據(jù)相關(guān)圖鑒和文獻進行鑒定[12]；對不產(chǎn)孢的菌株進行DNA提取，采用ITS序列分析進行鑒定[11]。

2.3 內(nèi)生真菌抑菌活性測定

采用平板對峙法測定抑菌活性[13]。將供試病原菌和內(nèi)生真菌分別接入PDA平板上活化培養(yǎng)5~7 d，在相同位置上用打孔器將其分別打成直徑約5 mm的菌餅，再將病原菌及內(nèi)生真菌菌餅接種于同一PDA平板上，2個菌餅相距5 cm。此外，將各病原菌菌餅分別單獨接種于PDA平板上，作為空白對照，每組3個重復(fù)。25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，觀察病原菌生長狀況及抑菌圈大小[14-16]。

2.4 數(shù)據(jù)分析

采用分離率（isolation rate，IR）、定殖率（colonization rate，CR）、相對頻率（relative frequence，RF）以及多樣性指數(shù)(biodiversity index, H’)來分析油茶內(nèi)生真菌的多樣性、優(yōu)勢菌群以及分布特性等[17]。計算方法如下：

分離率=內(nèi)生真菌株數(shù)/組織塊總數(shù)′100% （1）

定殖率=產(chǎn)菌組織塊數(shù)/組織塊總數(shù)′100% （2）

相對頻率=某種菌的株數(shù)/菌株總數(shù)′100% （3）

Shannon-Weiner指數(shù)' =-∑i×lni（4）

Simpson多樣性指數(shù)= 1-∑i2（5）

i=某種菌的株數(shù)/菌株總數(shù) （6）

均勻度指數(shù)='/Ln() （7）

'為Shannon-Wiener指數(shù)；為物種數(shù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同地區(qū)油茶內(nèi)生真菌的組成

從3個省份采集油茶葉片、莖、樹皮和果實的720個組織塊中總共分離出352株內(nèi)生真菌，隸屬于34屬56種。其中從樹皮中分離出38種，果中23種，葉片中22種，莖中18種，只有4種內(nèi)生真菌同時存在于油茶的各個組織中。油茶內(nèi)生真菌的優(yōu)勢屬為球座菌屬（相對率，17.33%）、擬莖點屬（相對頻率，16.19%）、刺盤孢屬（相對頻率，13.35%）以及鏈格孢屬（相對頻率，6.25%）（表2）。

表2 油茶內(nèi)生真菌的種類組成及相對頻率

-#:從葉中分離; -&:從莖中分離;-*:從樹皮中分離;-$:從果實中分離; MS:無孢菌類;ND:未確定;定殖率;RF：相對頻率

3.2 不同地區(qū)油茶不同組織的內(nèi)生真菌定殖率、分離率和多樣性比較

油茶內(nèi)生真菌菌群因采樣地不同而有區(qū)別（表3）。從分離率上看，其中江西144株（59.17%）、湖南110株（45.00%）、福建98株（39.58%）。從定殖率上看，江西（60.00%）>湖南（54.58%）>福建（40.41%）。油茶內(nèi)生真菌總的Shannon-Weiner指數(shù)(')為3.37，而3個地區(qū)的油茶內(nèi)生真菌Simposon多樣性指數(shù)和Shannon-Weiner多樣性指數(shù)分別介于0.727 3~0.921 6和1.540 3~2.876 9。其中江西的油茶內(nèi)生真菌多樣性指數(shù)最高，Simpson多樣性指數(shù)()和Shannon-Weiner指數(shù)(')分別為0.696 3和1.274 9；福建的最低，和'分別為0.692 8和1.265 7。三地油茶內(nèi)生真菌的Margalef豐富度指數(shù)分別為18.61，13.18和14.53，表明江西的油茶內(nèi)生真菌比湖南、福建的更為豐富。

油茶不同組織部位的定殖率和分離率差異也較大（表3）。油茶內(nèi)生真菌總分離率和總定殖率均為58.67％，不同組織部位內(nèi)生真菌的分離率和定殖率范圍在0.27~0.92。葉片（71.11%，73.89%）中最高，依次是樹皮（67.22%，68.33%）>果實（30.00%，30.00%）>莖（23.33%，23.33%）。從葉片中分離出116株內(nèi)生真菌，占總數(shù)的32.95％；其中膠孢炭疽菌（），芒果球座菌（），桔青霉菌（）為優(yōu)勢種。此外，在油茶組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)了內(nèi)生真菌特有種，其中4種僅在葉中發(fā)現(xiàn)，莖和果實中都發(fā)現(xiàn)了8種特有內(nèi)生真菌。蟲狀球座菌（）僅分布于樹皮內(nèi)，且為優(yōu)勢種。

表3 不同地區(qū)油茶不同組織的內(nèi)生真菌分離率和多樣性比較

3.3 油茶內(nèi)生真菌的抑菌能力

以7種植物病原菌為指示菌，包括4種病原真菌和3種病原細菌，測定56種油茶內(nèi)生真菌的抑菌活性。結(jié)果表明，56株油茶內(nèi)生真菌中有26株（46.43％）對指示病原菌具有抑制作用（表4）。其中有21株對所有病原真菌產(chǎn)生了抑菌作用，8株對所有病原細菌產(chǎn)生了抑菌作用。23株抗膠孢炭疽菌（），25株抗辣椒疫霉病菌（），23株抗水稻紋枯病菌（），26株抗茄枯萎病病菌（），18株大腸桿菌（），15株抗金黃色葡萄球菌（），14株抗枯草芽孢桿菌（）。此外，有8株（8/26）對所有的病原菌都表現(xiàn)出了抗菌活性，其中CF108的抑菌作用最強。有6株可以同時抑制6種病原菌，8株能夠同時抑制5種病原菌，3株能夠同時抑制4種病原菌，1種菌株能夠同時抑制3種病原菌。而有3種內(nèi)生真菌CF108，CF100，CF65能夠較明顯地抑制所有的病原菌。

表4 油茶內(nèi)生真菌培養(yǎng)物的抑菌活性

“+”抑菌活性（弱），“++”抑菌活性（中），“+++”抑菌活性（強）；“-”無抑菌活性

A:；B:；C:；D:；E:；F:；G:

4 結(jié)論與討論

植物內(nèi)生真菌是一類純天然的活性物質(zhì)，有著獨特且重要的應(yīng)用價值，其種類、分布以及定殖因植物種類不同而異，且大多數(shù)屬于子囊菌[18-19]。本試驗主要采用組織培養(yǎng)分離法，從江西、湖南、福建3個省份油茶的樹皮、莖、葉和果實共720個組織塊中分離出352株內(nèi)生真菌，經(jīng)形態(tài)學和分子學鑒定為34屬56種。其中球座菌屬（）、擬莖點屬（）、刺盤孢屬（）以及鏈格孢屬（）為優(yōu)勢屬，這些菌屬也存在于其他人的研究中[20-21]。

不同部位的內(nèi)生真菌定殖率不同，葉片的內(nèi)生真菌定殖率最高（71.11%），而莖的內(nèi)生真菌定殖率最低（23.33%）；內(nèi)生真菌分離率的變化規(guī)律與定殖率一致，最高的也是葉片（73.89%），最低為莖（23.33%），這與張林平等[22]研究結(jié)果相同。不同地區(qū)間油茶內(nèi)生真菌的分離率和定殖率不同，江西（59.17%，60.00%）>湖南（45.00%，54.58%）>福建（39.58%，40.41%），這可能是因為江西氣候宜人，濕度大的特點，利于油茶內(nèi)生真菌的生長和定殖。由此可見，分離出的內(nèi)生真菌的種類和數(shù)量受到取樣部位和取樣地點的影響。

內(nèi)生真菌具有抑菌性是由于其能夠產(chǎn)生抑菌性的物質(zhì)[23-24]。本研究發(fā)現(xiàn)油茶中存在26株能夠抑制病原菌的內(nèi)生真菌。其中3株內(nèi)生真菌CF108，CF100，CF65具有抑菌廣譜性，能夠抑菌7種病原菌。經(jīng)分子鑒定，CF108屬于楔孢菌屬（）、CF100和CF65屬于青霉屬（）。近年來，大量研究表明青霉菌屬（）能夠產(chǎn)生活性物質(zhì)且具有較好的抑菌和抗腫瘤的作用，如張志娟[25]以spTS67菌株為試驗材料，對其粗蛋白的生物活性進行了研究；鄭彩娟等[26]對紅樹尖瓣海蓮內(nèi)生真菌spJ41221進行代謝產(chǎn)物及其抗菌活性研究；葉科元[27]從南極海參體內(nèi)分離出菌株spS-1-16，對其次生產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)及其生物活性進行了研究，發(fā)現(xiàn)該菌株具有較好抑制腫瘤的作用。然而，目前對于楔孢菌屬（）的研究甚少，課題組下一步將對其活性成分進行研究，確定其抑菌成分，為開發(fā)更多油茶新型高效抑菌劑的研制提供理論基礎(chǔ)和科學依據(jù)。

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Diversity and Antibacterial Activity of Endophytic Fungi fromin Different Regions

CHEN Yan-liu1, PEI Nan-cai2, WU Fei1, ZHANG Yang1, GUO Chun-lan1, ZHANG Lin-ping1*, LI Zi-lin3

(1. Key Laboratory of State Forestry Administration on Forest Ecosystem Protection and Restoration of Poyang Lake Watershed (JAU), Nanchang 330045, China; 2. Research Institute of Tropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Guangzhou 510520, China; 3. Jiulian Mountain National Nature Reserve Administration, Longnan, Jiangxi 341702, China)

To explore the distribution and diversity of endophytic fungi in, strains with antibacterial activity were screened.The different tissues ofin Jiangxi, Hunan and Fujian were used as materials to separate endophytic fungi by tissue separation and to analyze the diversity and antimicrobial activity. The results showed that 352 endophytic fungi were isolated, belonging to 56 species of 34 genera, including 46 species (86.65%) of ascomycetes and 10 species (13.35%) of basidiomycetes. The genus,,andwere dominant genus, accounting for 17.33%, 16.19%, 13.35% and 6.25% of the total, respectively. From the separation position, the endophytic fungi had the highest separation rate and colonization rate of 71.11% and 73.89%, respectively, while the endophytic fungi in the bark had the highest diversity index. From the sampling point, the isolation and colonization rate of endophytic fungi offrom Jiangxi were the highest, followed by Hunan and Fujian. The antimicrobial assay showed that a total of 26 (46.43%) endophytic fungi had antibacterial activity, and 3 endophytic fungi（CF108，CF100，CF65） had obvious inhibitory effects on all pathogenic bacteria, indicating that these three endophytic fungi had a good application potential.

; endophytic fungi; diversity; antibacterial activity

S794.4

A

2095-3704（2018）04-0261-07

2018-09-29

國家自然科學基金項目（31660189、31570594）、江西省科技計劃項目（20161BAB204187）和江西省教育廳項目（GJJ150414）

陳言柳（1995—），男，碩士生，主要從事森林保護學研究，xiaoliuchen0316@126.com；

張林平，副教授，博士，zlping619@163.com。

10.3969/j.issn.2095-3704.2018.04.56

陳言柳, 裴男才, 吳斐, 等. 不同地區(qū)油茶內(nèi)生真菌多樣性及其抑菌活性[J]. 生物災(zāi)害科學, 2018, 41(4): 261-267.