李乾鵬，嵇江淮，安奕，李黎，趙磊△，李冬果△

(1.首都醫(yī)科大學(xué)，北京 100069；2.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院麻醉手術(shù)科，北京 100053；3.國(guó)家老年疾病臨床研究中心，北京100053；4.鄭州大學(xué)附屬洛陽(yáng)中心醫(yī)院，洛陽(yáng) 471009)

1 引 言

多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme, GBM)是神經(jīng)膠質(zhì)瘤中最為惡性的一種，在所有成年腦癌患者占比達(dá)60%，盡管現(xiàn)今醫(yī)療技術(shù)發(fā)展迅速，對(duì)GBM仍然缺乏有效的治療手段，患者的中位生存時(shí)間只有14至15個(gè)月[1-2]。隨著研究的發(fā)展，除了編碼基因，大量通過(guò)基因組而不是編碼蛋白轉(zhuǎn)錄的非編碼RNAs(non-coding RNAs,ncRNAs)被鑒別出來(lái)[3]。MicroRNAs (miRNAs)和lncRNAs是ncRNAs研究的重要方向。大量的研究表明，miRNAs在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因的表達(dá)，并參與多種生物過(guò)程和疾病[4]。最近，lncRNAs(這些長(zhǎng)度大于200 個(gè)核苷酸且具有很少或沒(méi)有蛋白質(zhì)編碼潛力的轉(zhuǎn)錄物[5])已經(jīng)成為生物醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。LncRNAs在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中起重要作用[6]。Wang等[7]研究表明，lncRNA LEF1-AS1在GBM中顯著高表達(dá)，并且敲出LEF1-AS1抑制GBM細(xì)胞的增殖和侵襲。Shi等發(fā)現(xiàn)lncRNA H19被證明可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤中癌癥的發(fā)展和侵襲[8]。盡管這些非編碼RNAs在GBM的進(jìn)程中發(fā)揮著重要的作用，但這些非編碼RNAs特別是lncRNAs的功能尚不清楚，特別是lncRNAs生物標(biāo)志物的鑒別仍具有很大的挑戰(zhàn)性。

與此同時(shí)，隨著對(duì)lncRNAs以及miRNAs等非編碼RNA研究的進(jìn)行，人們發(fā)現(xiàn)lncRNAs可以通過(guò)與miRNAs結(jié)合從而發(fā)揮RNA海綿的功能[6, 9]。最近的研究也表明，lncRNAs作為一種競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA，通過(guò)充當(dāng)miRNAs海綿來(lái)調(diào)控其他轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平[10-11]。Yu等[12]發(fā)現(xiàn)GAS5作為miR-222的ceRNA可以增加p27的表達(dá)水平，從而抑制肝臟纖維化進(jìn)展。另外有研究表明lncRNA lncHERG促進(jìn)GBM細(xì)胞的增值，并且lncHERG可以充當(dāng)腫瘤抑制因子miR-940的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA[13]。然而之前的報(bào)道主要關(guān)注在GBM中l(wèi)ncRNAs的鑒別，同時(shí)ceRNAs相關(guān)的幾個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)已經(jīng)被開(kāi)發(fā)出來(lái)用于lncRNAs功能的研究[11, 14]。這些研究結(jié)果表明表達(dá)譜和網(wǎng)絡(luò)分析的整合可以用來(lái)識(shí)別風(fēng)險(xiǎn)的lncRNAs和潛在的治療靶點(diǎn)。目前在GBM中，lncRNAs作為ceRNA網(wǎng)絡(luò)的研究仍處于初步階段，有效地識(shí)別GBM中風(fēng)險(xiǎn)的致病因子對(duì)研究GBM的致病機(jī)制具有重要的意義。

在本研究中，我們整合多組數(shù)據(jù)，采用一種計(jì)算策略構(gòu)建GBM中l(wèi)ncRNAs介導(dǎo)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)。我們研究網(wǎng)絡(luò)中l(wèi)ncRNAs和mRNAs的拓?fù)鋵傩裕x取度和中介中心性前5%的節(jié)點(diǎn)作為hub節(jié)點(diǎn)，從而進(jìn)一步構(gòu)建GBM中l(wèi)ncRNAs介導(dǎo)的hub-ceRNA網(wǎng)絡(luò)。最后，我們對(duì)網(wǎng)絡(luò)中的基因進(jìn)行功能分析。我們的研究將會(huì)幫助理解癌癥相關(guān)的lncRNAs介導(dǎo)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)也為識(shí)別GBM風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)記物提出新的見(jiàn)解。

2 數(shù)據(jù)來(lái)源及方法

2.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

GBM的表達(dá)譜數(shù)據(jù)(共計(jì)159個(gè)腫瘤樣本)收集于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)。我們從miRTarBase (Release 7.0)數(shù)據(jù)庫(kù)[15]下載實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的mRNA-miRNA關(guān)系對(duì)。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的lncRNA-miRNA關(guān)系對(duì)RAID V2.0 數(shù)據(jù)庫(kù)[16]中獲取。對(duì)GBM的表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理后，我們利用gencode中全基因組的注釋文件(V19)[17]重新注釋出lncRNA的表達(dá)譜數(shù)據(jù)和mRNA的表達(dá)譜數(shù)據(jù)。

2.2 GBM中ceRNAs關(guān)系對(duì)的鑒別

我們將從上述兩個(gè)miRNA靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的lncRNA-miRNA和mRNA-miRNA相互作用關(guān)系對(duì)進(jìn)行初步的匹配，保留在mRNA和lncRNA之間共享同一個(gè)miRNA的ceRNA關(guān)系對(duì)。為了能夠評(píng)估每個(gè)lncRNA和mRNA之間共享的miRNAs的顯著性，我們用超幾何分布來(lái)鑒別競(jìng)爭(zhēng)性lncRNA-mRNA關(guān)系對(duì)。見(jiàn)式(1)，整個(gè)基因組中miRNA總數(shù)為N，其中K和M是每個(gè)lncRNA和mRNA相關(guān)的miRNAs數(shù)量，x是每個(gè)lncRNA-mRNA關(guān)系對(duì)共享的miRNAs的數(shù)量。P值用來(lái)評(píng)估競(jìng)爭(zhēng)性lncRNA-mRNA關(guān)系對(duì)的顯著性。我們用錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(fdr)來(lái)矯正P值。如果矯正后的P值≤0.01，我們就認(rèn)為該ceRNAS對(duì)是顯著的。

(1)

為了鑒別GBM中l(wèi)ncRNAs介導(dǎo)的ceRNA對(duì)，基于匹配的lncRNA和mRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)，我們計(jì)算每一對(duì)顯著的lncRNA-mRNA關(guān)系對(duì)的皮爾森相關(guān)系數(shù)，見(jiàn)式(2)，式中cov(X,Y)是變量X和Y的協(xié)方差，σX和σY分別是X和Y的標(biāo)準(zhǔn)差。我們把P值≤0.01作為閾值。

(2)

2.3 hub網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和lncRNAs功能的預(yù)測(cè)

研究表明一些hub節(jié)點(diǎn)和瓶頸節(jié)點(diǎn)可能成為網(wǎng)絡(luò)中癌癥的預(yù)后因子，并且hub節(jié)點(diǎn)通常被定義為網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的前10%～20%[18-19]。我們對(duì)構(gòu)建的GBM相關(guān)的ceRNAs進(jìn)行拓?fù)浞治觯芯烤W(wǎng)絡(luò)中l(wèi)ncRNAs和mRNAs的拓?fù)鋵傩?，我們定義網(wǎng)絡(luò)中度前5% 的節(jié)點(diǎn)為hub節(jié)點(diǎn)，中介中心性(betweenness centrality，BC)前5%的節(jié)點(diǎn)為瓶頸節(jié)點(diǎn)。我們?nèi)ub節(jié)點(diǎn)和瓶頸節(jié)點(diǎn)的交集作為GBM中ceRNA網(wǎng)絡(luò)新的hub節(jié)點(diǎn)。這些hub節(jié)點(diǎn)被用來(lái)構(gòu)建GBM中l(wèi)ncRNAs介導(dǎo)的hub-ceRNA網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)用Cytoscape(v3.6.1)軟件可視化[20]。

我們用Bioconductor包“ clusterProfiler”[21]來(lái)預(yù)測(cè)lncRNAs的功能。通過(guò)Benjamini-Hochberg方法(BH)校正P值，如果矯正后的P值≤0.05，該GO項(xiàng)和富集通路就認(rèn)為是顯著的。

3 結(jié)果

為了全面的評(píng)估lncRNAs介導(dǎo)的ceRNAs關(guān)系對(duì)，我們采用一種策略來(lái)逐步鑒別顯著的lncRNA-mRNA競(jìng)爭(zhēng)性關(guān)系對(duì)。從數(shù)據(jù)庫(kù)中收集實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的lncRNA-miRNA和mRNA-miRNA相互作用關(guān)系對(duì)。在對(duì)兩類(lèi)關(guān)系對(duì)進(jìn)行初步匹配后，我們用超幾何分布來(lái)計(jì)算每個(gè)lncRNA-mRNA對(duì)共享的miRNAs的顯著性。保留顯著的lncRNA-mRNA競(jìng)爭(zhēng)性關(guān)系對(duì)用作進(jìn)一步的鑒別。為了鑒別GBM中共表達(dá)的ceRNAs對(duì)，我們計(jì)算每個(gè)候選的ceRNA對(duì)的皮爾森相關(guān)系數(shù)。選取PCC>0的ceRNAs關(guān)系對(duì)，總共有25536對(duì)。其中mRNA有2439個(gè)，lncRNA有575個(gè)。見(jiàn)圖1A，我們用這些關(guān)系對(duì)構(gòu)建GBM相關(guān)的ceRNA背景網(wǎng)絡(luò)。其中橘黃色的圓點(diǎn)代表lncRNA，藍(lán)色的圓點(diǎn)代表mRNA，一個(gè)lncRNA-mRNA對(duì)我們用紅線連接。從圖中可以看出大部分的lncRNA集中在網(wǎng)絡(luò)的中央，mRNA多分布在網(wǎng)絡(luò)的四周。接著我們對(duì)網(wǎng)絡(luò)中的lncRNAs和mRNAs進(jìn)行拓?fù)浞治觥Ｒ?jiàn)圖1B，發(fā)現(xiàn)lncRNAs的節(jié)點(diǎn)度和BC遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于mRNAs的節(jié)點(diǎn)度和BC。因此，我們認(rèn)為在GBM相關(guān)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)中，lncRNA的調(diào)控占據(jù)主導(dǎo)地位。

圖1 GBM相關(guān)的ceRNA背景網(wǎng)絡(luò)和拓?fù)浞治鯢ig 1 GBM related ceRNA background network and topology analysis

為了構(gòu)建GBM中l(wèi)ncRNAs介導(dǎo)的hub-ceRNA網(wǎng)絡(luò)，選取度和BC前5%的節(jié)點(diǎn)作為新的hub節(jié)點(diǎn)。其中l(wèi)ncRNA有23個(gè)，mRNA有96個(gè)。我們基于之前的ceRNA關(guān)系對(duì)用這些lncRNAs和mRNAs構(gòu)建hub節(jié)點(diǎn)的ceRNAs網(wǎng)絡(luò)，共426對(duì)。見(jiàn)圖2A，其中藍(lán)色表示mRNA，橘黃色表示lncRNA，節(jié)點(diǎn)的大小表示節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的度。

為了研究這些hub-ceRNA 中l(wèi)ncRNAs的可能功能，我們顯著富集的功能項(xiàng)去注釋網(wǎng)絡(luò)中的編碼基因。圖2展示了顯著性靠前的GO富集項(xiàng)和KEGG富集項(xiàng)。結(jié)果顯示這些hub節(jié)點(diǎn)的lncRNA顯著富集的GO項(xiàng)為上皮細(xì)胞增殖(GO:0050673)，肽酰絲氨酸磷酸化(GO:0018105)，細(xì)胞周期停滯(GO:0007050)和肌細(xì)胞增殖(GO:0033002)。顯著富集的通路為癌癥中的miRNA(hsa05206)，內(nèi)分泌抵抗(hsa01522)和乳腺癌(hsa05224)。

圖2 GBM中l(wèi)ncRNAs介導(dǎo)的hub-ceRNA網(wǎng)絡(luò)和功能富集分析Fig 2 Analysis of lncRNAs-mediated hub-ceRNA network and functional enrichment in GBM

4 討論

近年來(lái)，ceRNA在癌癥中的研究已經(jīng)引起廣泛的關(guān)注。最近的研究表明，人類(lèi)lncRNAs被發(fā)現(xiàn)與mRNAs競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合miRNAs，從而通過(guò)間接轉(zhuǎn)錄后機(jī)制調(diào)控mRNAs的表達(dá)水平[22]。Yang等研究表明GBM中ceRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)與典型致癌途徑有關(guān)[23]。

在本研究中，我們利用GBM的表達(dá)譜數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的miRNA靶點(diǎn)關(guān)系對(duì)，構(gòu)建GBM相關(guān)的ceRNA關(guān)系對(duì)。通常，節(jié)點(diǎn)的度越高表明該節(jié)點(diǎn)為hub節(jié)點(diǎn)，可以參與更多的ceRNAs相互作用。而節(jié)點(diǎn)的中介中心性越高表明該節(jié)點(diǎn)更有可能是一個(gè)瓶頸節(jié)點(diǎn)，可以作為連接不同網(wǎng)絡(luò)模塊的橋梁。因此，我們選取度和中介中心性前5%的節(jié)點(diǎn)作為新的hub節(jié)點(diǎn)，并用這些lncRNAs和mRNAs構(gòu)建hub-ceRNA網(wǎng)絡(luò)。Yang等[24]研究表明MCM3AP-AS1在GBM中下調(diào)，并且敲除MCM3AP-AS1可以抑制GBM的血管生成。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)表明敲掉AKT3基因抑制GBM細(xì)胞的侵襲[25]。在我們的hub-ceRNA網(wǎng)絡(luò)中，也發(fā)現(xiàn)MCM3AP-AS1- AKT3 ceRNA對(duì)的存在。因此，我們推斷MCM3AP-AS1- AKT3 ceRNA對(duì)可能是GBM治療的潛在靶點(diǎn)。同時(shí)，我們通過(guò)利用GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)[26]篩選hub-ceRNA網(wǎng)絡(luò)中的lncRNAs，還發(fā)現(xiàn)其中CASC2和NPHP3-AS1兩個(gè)lncRNA與星形細(xì)胞瘤有關(guān)。

為了進(jìn)一步分析這些lncRNAs的功能，我們對(duì)在hub-ceRNA網(wǎng)絡(luò)圖中與lncRNAs共表達(dá)的基因做功能富集分析。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在顯著富集的GO項(xiàng)中，有多個(gè)GO項(xiàng)與細(xì)胞的增殖有關(guān)，另外還發(fā)現(xiàn)了與膠質(zhì)生成(GO:0042063)有關(guān)的GO項(xiàng)。并且這些GO項(xiàng)都是顯著性排名靠前的GO項(xiàng)。研究結(jié)果進(jìn)一步表明，在我們的hub-ceRNA網(wǎng)絡(luò)中的這些lncRNAs和mRNAs可能是GBM相關(guān)的靶點(diǎn)基因。但是目前對(duì)GBM中l(wèi)ncRNAs功能的研究認(rèn)識(shí)尚淺，我們將進(jìn)一步探索與GBM相關(guān)的ceRNAs對(duì)，為GBM診斷預(yù)后提供更加準(zhǔn)確的治療靶點(diǎn)。