王愛利，王悅，郭佳，劉磊，李晶晶，鄧林紅△

(1.常州大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程與健康科學(xué)研究院暨常州市呼吸醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，常州 213164;2.常州大學(xué) 制藥與生命科學(xué)學(xué)院/護(hù)理學(xué)院，常州 213164)

1 引 言

氣道高反應(yīng)性(airway hyperresponsiveness，AHR)是哮喘的重要病理生理學(xué)特征[1]。目前β2受體激動劑是降低AHR的最有效藥物，但停藥后常會引起AHR復(fù)發(fā)，且部分哮喘患者會產(chǎn)生抗藥性而使治療失效，故有必要尋求其它能有效緩解AHR的替代藥物。穿山龍總皂苷為植物穿山龍薯蕷根莖的提取物，已知其具有調(diào)節(jié)免疫、改善心血管功能、鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘等多種藥理作用[2]。近期有研究報(bào)道穿山龍總皂苷可抑制哮喘模型動物的氣道炎癥反應(yīng)[3]。例如，在哮喘患者的支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)、血清、痰液及肺組織中發(fā)現(xiàn)炎癥因子白介素-17A(interleukin-17A，IL-17A)均升高，其水平與哮喘嚴(yán)重程度相關(guān)[4]；哮喘患者高表達(dá)的IL-17A可作用于上皮下的成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞使之增殖，誘導(dǎo)氣道重塑，加重AHR[5]；而穿山龍總皂苷則能通過抑制IL-17A的作用抑制炎癥反應(yīng)[6]。但目前對其是否可緩解AHR未見有研究。因此，本研究采用臭氧(ozone, O3)應(yīng)激小鼠，以分別建立急性、亞急性AHR模型，進(jìn)而觀察穿山龍總皂苷對小鼠AHR模型中氣道阻力的影響以及IL-17A的相關(guān)變化，初步探討穿山龍總皂苷通過降低IL-17A水平而抑制AHR的作用機(jī)制，為尋找治療AHR的中草藥提供新的思路。

2 材料和方法

2.1 試劑與動物

2.1.1實(shí)驗(yàn)動物 選取SPF級雄性Balb/c小鼠30只，6～8周齡，體重20±2 g，由常州卡文斯動物有限公司提供，動物合格證號: No. SCXK-(JS)-2016-0010。

2.1.2實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 穿山龍總皂苷(南京普怡生物)；戊巴比妥鈉(德國Merck)；小鼠IL-17A ELISA試劑盒(武漢Proteintech)；蛋白定量試劑盒(上海BIO-RAD)；穿山龍總皂苷及醋酸潑尼松以含0.01% 吐溫80為溶媒的0.9% NaCl(生理鹽水)做溶劑當(dāng)日配制。小動物肺功能檢測儀(加拿大SCIREQ)；臭氧發(fā)生器(北京力天)；酶標(biāo)儀(美國TECAN)。

2.2 O3誘導(dǎo)急性、亞急性AHR小鼠模型

2.2.1急性AHR小鼠模型 小鼠隨機(jī)分成6組：正常對照組、O3應(yīng)激組、穿山龍總皂苷治療組與醋酸潑尼松治療組，其中穿山龍總皂苷治療組分為高、中、低劑量3組，高、中、低劑量按小鼠體重計(jì)算分別對應(yīng)為80、40、20 mg/kg，醋酸潑尼松治療組為陽性對照，劑量按小鼠體重計(jì)算為10 mg/kg。除正常組外，各組均接受臭氧應(yīng)激。方法為將小鼠放置在透明塑料箱內(nèi)，利用空氣泵產(chǎn)生空氣，臭氧發(fā)生器產(chǎn)生臭氧，臭氧與新鮮空氣在真空泵作用下混合，并通過插入透明塑料箱內(nèi)的臭氧濃度監(jiān)測儀實(shí)時(shí)監(jiān)測箱內(nèi)臭氧濃度，根據(jù)臭氧濃度監(jiān)測儀顯示的臭氧濃度調(diào)節(jié)空氣流量閥門使箱內(nèi)臭氧濃度維持在1.9～2.1 ppm范圍內(nèi)，以下均標(biāo)記為2 ppm[7]，急性AHR模型為臭氧應(yīng)激組小鼠當(dāng)天口鼻吸入2 ppm的臭氧一次性3 h。

2.2.2亞急性AHR小鼠模型 動物分組與實(shí)驗(yàn)方法同上，但臭氧應(yīng)激組小鼠每天上午定時(shí)口鼻吸入2 ppm 臭氧3 h，每隔1天1次，共3次。

2.2.3動物給藥 臭氧應(yīng)激24 h后，治療組分別霧化吸入穿山龍總皂苷80、40、20 mg/kg劑量，陽性對照組霧化吸入醋酸潑尼松混懸液10 mg/kg，空白對照組霧化吸入生理鹽水[6]。各組均給藥30 min，霧化頻率為每隔半小時(shí)1次共3 次。所有實(shí)驗(yàn)組均在末次激發(fā)后24 h，進(jìn)行氣道阻力及氣道炎癥檢測。

2.3 小鼠氣道阻力檢測

小鼠用戊巴比妥鈉(60 mg/kg)經(jīng)腹腔注射、氣管切開后，連接FlexiVent小動物肺功能儀檢測氣道阻力(Rrs)，待呼吸平穩(wěn)后，向霧化器內(nèi)加入50 μL生理鹽水(基線)及1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100 mg/mL濃度梯度的乙酰甲膽堿(Methacholine, Mch)，每個(gè)濃度測定3 min記錄12次Rrs峰值并取其平均值計(jì)算肺阻力[8]。

2.4 肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)細(xì)胞總數(shù)及分類計(jì)數(shù)

通過留置針向小鼠肺內(nèi)注入0.5 mL 4℃預(yù)冷的生理鹽水，重復(fù)此操作3次，回收率達(dá)到80 %，于12 000 g，4℃離心10 min，收集上清液存于-80℃?zhèn)溆?。?xì)胞沉淀用100 μL生理鹽水重懸，取10 μL計(jì)細(xì)胞總數(shù)，將剩余的細(xì)胞懸液涂片、行瑞氏-吉姆薩染色，在光鏡下計(jì)算細(xì)胞總數(shù)及分類計(jì)數(shù)。

2.5 BALF中IL-17A的檢測

用生理鹽水分3次通過插入的留置針灌入支氣管肺泡內(nèi)，然后回收，離心，收集上清液用于檢測炎癥因子IL-17A的水平，操作步驟按照小鼠的IL-17A ELISA試劑盒說明書進(jìn)行，采用酶標(biāo)儀450 nm 波長下檢測OD 值。

2.6 肺組織勻漿液中總蛋白及IL-17A的檢測

小鼠被麻醉開胸取出肺組織，制備10%肺組織勻漿液。于12 000 g，4℃下離心20 min，上清液中總蛋白濃度用雙茴香寧酸(bicinchonininc acid,BCA)法蛋白濃度定量試劑盒測定，按ELISA試劑盒說明書測定IL-17A水平。根據(jù)組織勻漿總蛋白濃度計(jì)算出每100 mg肺組織炎癥因子濃度，炎癥因子濃度(pg/100 mg肺組織)=實(shí)測值(pg/mL)/肺組織重量×100 mg/總蛋白濃度(mg/mL)，炎癥因子的表達(dá)方法均為ELISA實(shí)測結(jié)果與100 mg肺組織勻漿總蛋白的比值[9]。

2.7 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±SD)表示，用GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組以上比較應(yīng)用單因素方差分析，組間差異采用t檢驗(yàn)，p<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 臭氧誘導(dǎo)小鼠急性、亞急性AHR模型的建立及表征

3.1.1臭氧誘導(dǎo)AHR模型小鼠氣道阻力變化 由圖1可見，急性、亞急性模型臭氧組小鼠氣道阻力值均隨著Mch劑量的增加而呈現(xiàn)上升趨勢，當(dāng)Mch刺激濃度增加到12.5 mg/mL后，與正常對照組相比，急性、亞急性臭氧組氣道阻力值均顯著性增加(**p<0.01)。

圖1臭氧誘導(dǎo)AHR模型隨乙酰甲膽堿刺激的變化(急性(A)、亞急性(B);n=5, **p<0.01; *p<0.05vs正常組)

Fig1Changeofairwayresistanceinozone-inducedAHRmodelmiceinresponsetomethacholine(Mch)stimulation(acute(A)、subacute(B) ;n=5, **p<0.01; *p<0.05vscontrol)

3.1.2臭氧誘導(dǎo)AHR模型小鼠BALF細(xì)胞總數(shù)及分類計(jì)數(shù)的變化 由圖2可見，臭氧組小鼠氣道炎癥較對照組明顯增加，正常小鼠BALF中主要表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞增多，而中性粒細(xì)胞含量甚少，與對照組相比，急性、亞急性模型臭氧組小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)、巨噬細(xì)胞數(shù)及嗜中性粒細(xì)胞數(shù)均明顯升高(**p<0.01)，以上結(jié)果表明本研究成功建立了急性、亞急性AHR模型。

圖2臭氧誘導(dǎo)AHR模型小鼠肺泡灌洗液中細(xì)胞總數(shù)及分類計(jì)數(shù)(急性(A)、亞急性(B);Eos:嗜酸性細(xì)胞;Neu:中性粒細(xì)胞;Lym:淋巴細(xì)胞;Mac:巨噬細(xì)胞;n=5, **p<0.01; *p<0.05vs正常組)

Fig2MeannumbersoftotalcellsanddifferentialcellsrecoveredfromBALFinozone-inducedAHRmodelmice(acute(A)、subacute(B);Eos:Eosinophils;Neu:Neutrophils;Lym:Lymphocytes;Mac:Macrophages;n=5, **p<0.01; *p<0.05vscontrol)

3.2 穿山龍總皂苷對AHR模型小鼠氣道阻力的影響

圖3 A、B顯示穿山龍總皂苷對臭氧誘導(dǎo)的急性、亞急性AHR模型小鼠氣道阻力的影響結(jié)果，可見隨著Mch激發(fā)濃度的增加，各組氣道阻力值均逐漸增加，但與生理鹽水組相比，霧化吸入濃度梯度的穿山龍總皂苷藥物后氣道阻力值均有所降低，高濃度的穿山龍總皂苷降低氣道阻力的效果更加明顯。

圖3穿山龍總皂苷對臭氧誘導(dǎo)AHR模型小鼠氣道阻力的影響(急性(A)、亞急性(B);n=5, **p<0.01; *p<0.05vs生理鹽水)

Fig3EffectofCDNonairwayresistanceofozone-inducedAHRmodlemice.(acute(A)、subacute(B);n=5, **p<0.01; *p<0.05vs生理鹽水)

3.3 穿山龍總皂苷對AHR模型小鼠BALF中IL-17A的影響

圖4 A、B顯示穿山龍總皂苷對臭氧誘導(dǎo)的急性、亞急性AHR模型小鼠BALF中IL-17A的影響結(jié)果，可見生理鹽水組BALF中IL-17A水平較正常組明顯升高(**p<0.01)；霧化吸入梯度劑量的穿山龍總皂苷后，各藥物治療組IL-17A的水平較生理鹽水組(空白溶劑對照組)顯著降低，且藥物濃度越高穿山龍總皂苷降低IL-17A的水平越明顯。

3.4 穿山龍總皂苷對急性AHR模型小鼠肺組織勻漿液中IL-17A的影響

圖5顯示穿山龍總皂苷對臭氧誘導(dǎo)的急性AHR模型小鼠肺組織勻漿液中IL-17A的影響結(jié)果，可見生理鹽水組肺組織勻漿中IL-17A水平明顯升高，與正常組相比有顯著性差異(**P<0.01)，各穿山龍總皂苷治療組與陰性對照組相比，IL-17A水平明顯降低，當(dāng)霧化吸入80、40 mg/kg的穿山龍總皂苷時(shí)可顯著降低肺勻漿液中IL-17A的水平(**p<0.01)，其作用效果優(yōu)于10 mg/kg醋酸潑尼松懸液。

圖4穿山龍總皂苷對臭氧誘導(dǎo)AHR模型小鼠肺泡灌洗液中IL-17A的影響

(急性(A)、亞急性(B);n=5, **p<0.01vs正常, **p<0.01vs生理鹽水)

Fig4EffectofCDNonIL-17AinBALFofozone-inducedAHRmodlemice.(acute(A)、subacute(B);n=5, **p<0.01vscontrol, **p<0.01vs生理鹽水)

圖5穿山龍總皂苷對臭氧誘導(dǎo)的AHR模型小鼠急性肺組織勻漿液中IL-17A的影響。(n=5,**p<0.01vs.正常, **p<0.01vs生理鹽水)

Fig5EffectofCDNonIL-17Ainlungtissuehomogenatesofozone-inducedacuteAHRmodlemice(n=5,**p<0.01vs.control, **p<0.01vssaline)

4 討論

哮喘發(fā)病率的持續(xù)上升提示環(huán)境因素可能起重要作用。臭氧是環(huán)境中的有害因素，可以改變肺結(jié)構(gòu)和肺功能，導(dǎo)致哮喘癥狀，如氣道炎癥和氣道高反應(yīng)[10]。臭氧誘導(dǎo)產(chǎn)生AHR模型小鼠的方式通?？煞譃榧毙?、亞急性、及慢性三種[11]。由于慢性模型伴有肺炎，肺氣腫，氣道重塑等嚴(yán)重肺部病理變化，影響到對AHR的治療效果的評判[12]，而本研究旨在探究穿山龍總皂苷對AHR的治療作用，故選擇采用臭氧誘導(dǎo)小鼠建立急性[13]、亞急性AHR[14]模型。

研究證明急性、亞急性AHR模型中暴露于臭氧，可誘導(dǎo)嗜中性粒細(xì)胞氣道炎癥和氣道阻力增加[15]。我們的研究也證實(shí)了這一現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，臭氧應(yīng)激后急性、亞急性氣道阻力及嗜中性粒炎癥細(xì)胞數(shù)均呈劑量依賴性增加。表明臭氧組小鼠存在AHR及氣道炎癥病理變化。動物實(shí)驗(yàn)表明穿山龍總皂苷對吸入卵清蛋白(ovalbumin, OVA)誘導(dǎo)的小鼠呼吸道炎癥具有良好的治療效果，可抑制Th2炎癥反應(yīng)、氣道重塑[3，16]。但穿山龍總皂苷對臭氧誘導(dǎo)的AHR的影響未見研究。本研究結(jié)果顯示，對急性模型而言，當(dāng)Mch的劑量達(dá)到25 mg/mL濃度激發(fā)時(shí)，霧化吸入80、40 mg/kg的穿山龍總皂苷均能顯著降低氣道阻力，但對于亞急性模型而言，霧化吸入80 mg/kg的穿山龍總皂苷可降低小鼠氣道阻力；當(dāng)Mch的劑量增加到100 mg/mL時(shí)，霧化吸入80、40、20 mg/kg劑量的穿山龍總皂苷均可降低兩模型組小鼠氣道阻力。因此，從本研究的結(jié)果看，不論對急性或亞急性AHR模型小鼠，霧化吸入梯度劑量的穿山龍總皂苷可不同程度降低Mch誘導(dǎo)的氣道阻力，且氣道阻力的降低程度呈劑量依賴性。這些結(jié)果從表象上證明，穿山龍總皂苷至少對臭氧誘導(dǎo)的急性、亞急性AHR模型小鼠具有有效緩解AHR的治療作用。

AHR的內(nèi)在機(jī)制是由于炎癥介質(zhì)導(dǎo)致氣道平滑肌產(chǎn)生急性收縮反應(yīng)[17]。而由Th17 細(xì)胞分泌的IL-17A是一種具有多種功能的強(qiáng)效致炎因子，可促進(jìn)組織炎癥發(fā)生，并參與AHR的發(fā)生[18]。文獻(xiàn)報(bào)道穿山龍總皂苷可通過抑制OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠體內(nèi)IL-17A 的水平，發(fā)揮治療哮喘的作用[6]。但穿山龍總皂苷對臭氧誘導(dǎo)的AHR模型小鼠氣道阻力的降低是否也與體內(nèi)IL-17A 的改變有關(guān)，尚未見報(bào)道。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，無論在急性、亞急性AHR模型小鼠中，臭氧刺激都會導(dǎo)致IL-17A的顯著增高。但對急性AHR模型而言，霧化吸入80 mg/kg的穿山龍總皂苷即可顯著降低肺泡灌洗液中IL-17A水平。對亞急性AHR模型而言，霧化吸入80、40、20 mg/kg的穿山龍總皂苷均可有效降低肺泡灌洗液中IL-17A的水平。本研究還發(fā)現(xiàn)霧化吸入80、40 mg/kg的穿山龍總皂苷也可降低急性AHR模型小鼠肺組織勻漿中IL-17A的水平。這些結(jié)果與氣道阻力的變化趨勢一致。因此，在臭氧誘導(dǎo)AHR模型中，AHR的產(chǎn)生很可能與研究報(bào)道的OVA通過驅(qū)動IL-17A上調(diào)，從而增強(qiáng)氣道平滑肌收縮，進(jìn)而誘導(dǎo)AHR[19]的機(jī)制一致。同時(shí)也說明穿山龍總皂苷很可能是通過抑制小鼠體內(nèi)IL-17A水平，而降低臭氧誘導(dǎo)AHR模型小鼠的氣道阻力，進(jìn)而達(dá)到緩解其AHR的作用。

綜上所述，霧化吸入穿山龍總皂苷(80、40、20 mg/kg)可不同程度降低急性、亞急性AHR，此作用可能與穿山龍總皂苷能夠降低IL-17A的水平相關(guān)，從而為穿山龍總皂苷緩解或治療AHR癥狀提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。