楊笑敏 王俊娟 王德龍 陸許可 陳修貴 郭麗雪 王帥 陳超王曉歌 韓明格 葉武威

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所 棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)部棉花遺傳改良重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，安陽(yáng) 455000）

S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下把甲基（-CH3）轉(zhuǎn)移到DNA分子中特定堿基上的過(guò)程稱(chēng)為DNA甲基化的過(guò)程［1］。多數(shù)發(fā)生在CpG島的胞嘧啶第5位碳原子（C5）上，通常發(fā)生在對(duì)稱(chēng)序列CG中，但是在CHG和CHH（H=A、C或T）序列中也有發(fā)生［2］。DNA甲基化是一種廣泛存在的表觀遺傳過(guò)程，包括轉(zhuǎn)座子的抑制、基因組印記［3］、X染色體失活［4］、細(xì)胞分化［5］和胚胎發(fā)育［6］。在脅迫條件下植物通過(guò)DNA甲基化過(guò)程，誘導(dǎo)一些與抗逆相關(guān)的基因表達(dá)，增強(qiáng)植物的抗逆性，維持植物的生長(zhǎng)發(fā)育和進(jìn)化過(guò)程［7］。DNA甲基化是一種植物響應(yīng)逆境脅迫的分子機(jī)制［8］。植物中存在2種DNA甲基化方式：一種是維持甲基化（Maintenance methylation），通過(guò)半保留復(fù)制把雙鏈DNA分子的一條鏈存在甲基化，另一條鏈沒(méi)被甲基化的親代甲基化模式傳遞給子代［9］；另一種是從頭甲基化（De novomethylation），通過(guò)不同的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化將不存在甲基化的DNA雙鏈形成甲基化［10］。植物中的C5-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶有4種，維持DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（Methyltransferase，MET）家族［11］；染色質(zhì)甲基化酶（Chromomethylase，CMT）家族［12］；Dnmt2；結(jié)構(gòu)域重排甲基轉(zhuǎn)移酶（Domains rearranged methyltransferase，DRM）家族可以在RNA指導(dǎo)下，催化胞嘧啶從頭甲基化，以及維持非CpG位點(diǎn)的甲基化［13］；MET、CMT與動(dòng)物的DNMT1 為同源［14］；DRM 與動(dòng)物的 DNMT3 同源［15］。

非生物脅迫嚴(yán)重影響和制約著農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。當(dāng)煙草發(fā)生滲透脅迫時(shí)（NicotianaL.）組織培養(yǎng)細(xì)胞的異染色質(zhì)區(qū)會(huì)發(fā)生DNA超甲基化［16］。CHROMOMETHYLASE3（SLCMT3）基因可以使Chr番茄果實(shí)的成熟，提高控制成熟關(guān)鍵基因的表達(dá)［17］；當(dāng)蘿卜（Raphanus sativusL.）受到重金屬鉻脅迫時(shí)DNA的甲基化水平會(huì)升高［18］；玉米（Zea maysL.）受到冷脅迫時(shí)，根系通過(guò)降低核小體中心DNA甲基化水平誘導(dǎo)ZmMI1表達(dá)，受到鹽脅迫時(shí)玉米幼苗zmPP2C甲基化將下調(diào)和zmGST表達(dá)量也下調(diào)［19］；大豆受干旱、冷、鹽脅迫時(shí)，根中CaDRM1和CaDRM2的表達(dá)量上調(diào)，以應(yīng)對(duì)脅迫壓力［20］；苜蓿種子發(fā)育和結(jié)瘤的早期階段MtDRM1和MtDRM2高度表達(dá)，MtDRM3在種子和結(jié)節(jié)發(fā)育階段表達(dá)量高［20］。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶與抗逆性密切相關(guān)，深入對(duì)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的作用機(jī)制進(jìn)行研究，對(duì)進(jìn)一步挖掘抗逆基因具有重要意義。

棉花作為重要的經(jīng)濟(jì)作物，其棉纖維可以制作成織物，棉籽可以榨油，在人們的日常生活中應(yīng)用廣泛。脅迫條件下，棉花產(chǎn)量會(huì)大幅度減產(chǎn)；DNA甲基轉(zhuǎn)移酶可以增強(qiáng)植物的耐受性，GhDMT3是DRM家族的一員，在水稻中鑒定出2個(gè)DRM家族相關(guān)基因、苜蓿中鑒定出4個(gè)DRM家族的成員、在大豆中發(fā)現(xiàn)5個(gè)DRM家族相關(guān)基因、在玉米和擬南芥中各含有2個(gè)DRM家族的成員，而棉花中的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶研究較少。本研究通過(guò)對(duì)棉花GhDMT3進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并構(gòu)建pYL156：GhDMT3沉默載體，對(duì)其進(jìn)行功能驗(yàn)證，為提高棉花抗逆性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

陸地棉TM-1由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所品種資源研究室保存。所用菌種為大腸桿菌E.coliDH5α，農(nóng)桿菌 LB3101、pYL156、pYL192（輔助載體）和pYL156：GhDMT3（陽(yáng)性對(duì)照載體）載體由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所基因組測(cè)序課題組提供。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取及cDNA的制備 按照北京艾德萊生物科技的RN38 EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取RNA，按照北京全式金的TransScript ΙΙ All-in -One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（One-Step gDNA Removal） 說(shuō)明書(shū)制備cDNA。

1.2.2GhDMT3的克隆 用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)GhDMT3引物（F：ATGGTTGACAATAATTCGGGTGG；R：TCAGATAATCATTGATTTTGTG），以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，PCR程序?yàn)?4℃ 5 min；94℃20 s，54℃ 20 s，72℃ 70s，34 個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，回收、純化，與T載連接，并轉(zhuǎn)入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性單克隆并測(cè)序，獲得正確的t-GhDMT3序列。

1.2.3 構(gòu)建pYL156：GhDMT3的VIGS載體 用EcoRⅠ和XmaⅠ雙酶切PYL156，獲得線(xiàn)性pYL156載體，以克隆載體t-GhDMT3為模板用引物in-VGhDMT3進(jìn)行擴(kuò)增，獲得VIGS片段。用in-FuSion技術(shù)將GhDMT3的VIGS沉默片段插入到線(xiàn)性的PYL156載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌，挑取陽(yáng)性單克隆測(cè)序，獲得正確的單克隆，并用EcoRⅠ和XmaⅠ雙酶切驗(yàn)證，成功構(gòu)建pYL156：GhDMT3載體。

1.2.4 pYL156：GhDMT3的VIGS沉默及表達(dá)量檢測(cè) 種植TM-1到兩片子葉平展時(shí)，用一次性的醫(yī)用注射器在葉片的背面，進(jìn)行VIGS注射，注射面積在75%以上。然后置于25℃黑暗培養(yǎng)24 h，處理結(jié)束后，在適宜的溫度（28℃ 14 h/25℃ 10 h）下保證幼苗正常生長(zhǎng)。當(dāng)出現(xiàn)白化后，對(duì)植株分別進(jìn)行冷（4℃）和干旱（自然干旱）處理，當(dāng)與對(duì)照出現(xiàn)表型差異時(shí)，測(cè)定GhDMT3的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 GhDMT3蛋白的理化性質(zhì)及親水性/疏水性分析

通過(guò)ExPASY網(wǎng)站的生物軟件ProtParam程序?qū)hDMT3編碼的蛋白進(jìn)行組分分析，該蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為71 107.02 kD，等電點(diǎn)為4.85，該基因編碼的蛋白質(zhì)分子式為C3151H4897N849O981S23，共計(jì)9 901個(gè)原子，編碼640個(gè)氨基酸，其中65個(gè)帶正電的氨基酸（Arg +Lys），96個(gè)帶負(fù)電的氨基酸（Asp+Glu），不穩(wěn)定系數(shù)為36.33，脂肪系數(shù)為81.81，總平均親水性為-0.364，預(yù)測(cè)該蛋白為酸性蛋白，不含有賴(lài)氨酸和絲氨酸，色氨酸含量最低為1.6%，亮氨酸含量最高為10.2%。

2.2 GhDMT3蛋白質(zhì)的親疏水性分析

圖1 GhDMT3蛋白的疏水性/親水性檢測(cè)

利用ProtScale網(wǎng)站對(duì)GhDMT3蛋白的親疏水性進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果（圖1）表明，在256位的S親水性最強(qiáng)分值為-2.357，在517位的F疏水性最強(qiáng)分值為1.210，親水性總平均值為-1.157，推測(cè)該基因的整個(gè)氨基酸序列中親水性氨基酸比疏水性氨基酸多，所以該蛋白為親水性蛋白。綜上所述，該基因編碼的蛋白具有一定的親水能力但不穩(wěn)定。

2.3 GhDMT3蛋白的跨膜分析

通過(guò)TMHMM網(wǎng)站對(duì)GhDMT3蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析（圖2），GhDMT3蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，屬于非跨膜蛋白，與該蛋白的疏水性區(qū)域分析結(jié)果基本一致。利用SignalP-4.0網(wǎng)站對(duì)GhDMT3蛋白的信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果為C值（剪切位點(diǎn)）為0.114，S值（信號(hào)肽）為0.109，Y值（綜合剪切點(diǎn)）為0.105（圖3）。GhDMT3蛋白并不是分泌型蛋白，不在細(xì)胞中發(fā)生遷移。

圖2 GhDMT3蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域分析

圖3 GhDMT3蛋白的信號(hào)肽預(yù)測(cè)

2.4 GhDMT3蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

圖4 GhDMT3基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)

通過(guò)軟件預(yù)測(cè)分析GhDMT3蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。結(jié)果（圖4）表明，無(wú)規(guī)則卷曲包含298個(gè)氨基酸殘基，占46.56%，α螺旋包含266個(gè)氨基酸殘基，占41.11%，延伸鏈包含67個(gè)氨基酸殘基，占10.47%，β-轉(zhuǎn)角包含33個(gè)氨基酸，占5.12%。

2.5 GhDMT3蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

使用軟件SWISS-MODEL預(yù)測(cè)GhDMT3蛋白的三維結(jié)構(gòu)，GhDMT3蛋白三維結(jié)構(gòu)以α螺旋為主（圖5），符合GhDMT3蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。

圖5 GhDMT3蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)

2.6 構(gòu)建GhDMT3的VIGS載體

利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增GhDMT3，轉(zhuǎn)T載體，獲得t-GhDMT3；以克隆載體t-GhDMT3為模板，對(duì)in-v-GhDMT3進(jìn)行擴(kuò)增，獲得VIGS片段（圖6-A）。用in-FuSion技術(shù)將GhDMT3的VIGS沉默片段插入到pYL156載體上，并用EcoRⅠ和XmaⅠ雙酶切驗(yàn)證（圖6-B），即成功構(gòu)建pYL156：GhDMT3載體。

2.7 VIGS侵染后棉花的表型和GhDMT3的表達(dá)量分析

圖6 VIGS載體pYL156：GhDMT3的構(gòu)建與驗(yàn)證

VIGS侵染棉花植株15 d左右，陽(yáng)性植株葉片白化明顯，其他正常生長(zhǎng)，用沒(méi)有侵染的棉花和用pYL156侵染的棉花作對(duì)照，對(duì)沉默植株進(jìn)行冷、干旱的脅迫處理。冷處理36 h后植株表型差異明顯（圖7-A），注射pYL156的植株與野生型的新生真葉枯萎卷曲，注射pYL156：GhDMT3的植株正常生長(zhǎng)，表型變化不明顯。pYL156侵染的棉花中在不同脅迫下表達(dá)量無(wú)顯著變化，與對(duì)照相比，用pYL156：GhDMT3侵染過(guò)的棉花GhDMT3轉(zhuǎn)錄水平明顯下降。根部下降最多；莖部次之；葉片下降最少（圖7-B）。

自然干旱6 d后植株表型差異明顯，注射pYL156的植株和野生型的子葉脫落，新生真葉發(fā)黃枯萎，嚴(yán)重失水，植株死亡，注射pYL156：GhDMT3的植株真葉沒(méi)有枯萎失水現(xiàn)象（圖8-A）。檢測(cè)pYL156：GhDMT3侵染過(guò)的棉花中GhDMT3的相對(duì)表達(dá)量，由圖可知pYL156侵染的棉花中在不同脅迫下表達(dá)量沒(méi)有變化，用pYL156：GhDMT3侵染過(guò)的棉花中GhDMT3轉(zhuǎn)錄水平與對(duì)照相比葉片中下降最多；莖部次之；根部下降最少（圖8-B）。

圖7 VIGS侵染后的棉花表型和冷脅迫36 h的棉花表型（A）；VIGS侵染成功冷脅迫處理后植株的相對(duì)表達(dá)量（B）

圖8 VIGS侵染后的表型和干旱脅迫6 d的表型（A）及VIGS侵染成功干旱脅迫處理后植株的相對(duì)表達(dá)量（B）

3 討論

DNA甲基轉(zhuǎn)移酶是DNA甲基化過(guò)程中的關(guān)鍵酶，在擬南芥［10］、水稻［21］、玉米［22］、大豆［20］、葡萄［23］、番茄［24］及蓖麻［25］等植物中鑒定出 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶。GhDMT3與蓖麻中的DRM家族基因編碼蛋白一致，該家族基因編碼蛋白為不穩(wěn)定的親水性蛋白，不具有跨膜結(jié)構(gòu)域，二級(jí)結(jié)構(gòu)以無(wú)規(guī)則卷曲、α螺旋為主為。通過(guò)分析GhDMT3三維結(jié)構(gòu)與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的典型結(jié)構(gòu)類(lèi)似，但是有一定的區(qū)別，具體原因需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)探明。

大豆的DRM基因在非生物脅迫期間轉(zhuǎn)錄水平較高參與誘導(dǎo)DNA甲基化改變［20］，當(dāng)擬南芥drm1和drm2雙突變時(shí)會(huì)造成所有已知模式的胞嘧啶從頭甲基化均有缺失［10］，DRM家族基因?qū)τ贔WA和SUP的基因沉默是重要的，可以通過(guò)不同的機(jī)制使直接重復(fù)和反向重復(fù)發(fā)生甲基化［26］。通過(guò)沉默GhDMT3基因，證明該基因與抗逆性相關(guān)，為明確該基因的功能奠定基礎(chǔ)，而該基因的具體功能需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

成功構(gòu)建了GhDMT3的VIGS沉默載體，獲得轉(zhuǎn)基因植株，在冷、干旱脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因植株抵抗力增強(qiáng)。