張海容，陳金娥，高瑞苑

(忻州師范學(xué)院 生化分析技術(shù)研究所，山西 忻州 034000

芝麻是我國重要的優(yōu)質(zhì)油料和特色農(nóng)作物，種植面積十分廣泛，主要分布在河南、湖北、安徽、山東等省，約占世界芝麻總產(chǎn)量的34%，因其含油量高而素有油料作物“皇后”之美譽，具有極高的營養(yǎng)價值[1]。芝麻中以脂肪和蛋白質(zhì)為主，還含有機酸類、黃酮類、多酚類、木脂素類、維生素及人體必需氨基酸[2-4]、微量元素[5]等營養(yǎng)成分。迄今為止，我國80%以上的芝麻用來榨取芝麻油，芝麻餅粕的年產(chǎn)量超過50萬t。而脫脂后的芝麻粕主要作為飼料或肥料使用，深加工和綜合利用的研究尤顯不足，造成巨大的資源浪費。因此，深入研究開發(fā)芝麻粕中對人類有益活性成分非常重要，進而達(dá)到最大化利用資源的目的。

目前，對芝麻粕中蛋白質(zhì)[6-8]、木脂素類[9-10]及其抗氧化活性研究較多，而芝麻粕中多酚及其抗氧化活性的研究鮮有報道[4]。植物多酚又名植物單寧，主要存在于植物的皮、根、葉、果中，在植物中的含量僅次于纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，具有抗氧化、抗衰老、調(diào)節(jié)免疫、抗炎鎮(zhèn)痛、抗癌抗腫瘤、抗心腦血管疾病和抑菌抗病毒等作用[11]。超聲波法是一種現(xiàn)代分離技術(shù)[12-16]，利用超聲波的空化作用、機械作用以及熱效應(yīng)，可加速細(xì)胞壁的破碎，促進胞內(nèi)有效成分的溶出。因超聲波法提取效率高，已經(jīng)成為提取植物活性成分研究領(lǐng)域的熱點技術(shù)。因此，本文選用芝麻粕為試驗對象，研究超聲輔助乙醇提取芝麻粕中多酚類化合物，采用Box-Behnken設(shè)計響應(yīng)面法對所選試驗參數(shù)進行分析和優(yōu)化，確定芝麻粕中多酚的最佳提取工藝條件；并通過對DPPH·清除作用進行抗氧化活性[17]分析與評價，為芝麻粕的深度開發(fā)和綜合利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑

芝麻粕，取自山西省神池糧油食品加工廠；沒食子酸丙酯標(biāo)準(zhǔn)品(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，實驗用重蒸水溶解制得1 000 μg/mL儲備液；FeSO4·7H2O、C4H4O6NaK·4H2O、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、無水乙醇、叔丁基對苯二酚(TBHQ)、2,2-二苯基-1-苦基肼(DPPH)，均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

UV-1800紫外可見分光光度計，日本島津公司；AB204-N型電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器；AL204-N旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；501A型超級數(shù)顯恒溫水??；SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水真空泵。

1.2 試驗方法

1.2.1 芝麻粕中多酚的提取

將芝麻粕于100℃真空干燥箱中干燥10 h，粉碎過40目篩，保存?zhèn)溆?。?zhǔn)確稱取芝麻粕粉1.000 g于錐形瓶中，加入提取溶劑，設(shè)定不同超聲功率、超聲時間、液料比和超聲溫度提取芝麻粕2次，合并提取液，離心10 min除雜，用重蒸水定容于100 mL容量瓶中，保存待測。以多酚產(chǎn)率為指標(biāo)，采用單因素試驗考察不同提取溶劑、超聲功率、超聲時間、超聲溫度以及液料比對多酚產(chǎn)率的影響。在此基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面試驗進行工藝優(yōu)化。

1.2.2 多酚含量的測定

采用酒石酸亞鐵比色法測定。酒石酸亞鐵顯色劑的配制：準(zhǔn)確稱取1.00 g硫酸亞鐵(FeSO4·7H2O)和5.00 g酒石酸鉀鈉(C4H4O6NaK·4H2O)，用重蒸水溶解混合定容于1 000 mL容量瓶中。pH為7.4磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液的配制：準(zhǔn)確稱取6.02 g含有12個結(jié)晶水的磷酸氫二鈉、0.50 g含有2個結(jié)晶水磷酸二氫鈉，用重蒸水溶解混合定容于100 mL容量瓶中。

沒食子酸丙酯標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確吸取沒食子酸丙酯儲備液0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00 mL分別置于10 mL比色管中，再各加入5 mL顯色劑，用緩沖液定容至刻度。以試劑空白作參比，在540 nm波長處測定吸光度，得吸光度(A)與沒食子酸丙酯質(zhì)量濃度(C)的標(biāo)準(zhǔn)回歸方程：A=0.012 4C-0.016 1，R2=0.999 3。

芝麻粕提取液多酚含量的測定：準(zhǔn)確吸取2 mL提取液至10 mL的比色管中，然后加入5 mL顯色劑，用緩沖液定容至刻度。以試劑空白作參比，在540 nm波長處測定吸光度，代入回歸方程計算多酚產(chǎn)率，計算公式如下：

式中：C為芝麻粕提取液測得多酚質(zhì)量濃度，μg/mL；γ為稀釋倍數(shù)；V為芝麻粕提取液體積， mL；m為芝麻粕干粉質(zhì)量，g；106為換算系數(shù)。

1.2.3 多酚抗氧化活性(DPPH法)測定

取不同體積芝麻粕多酚提取液及2 mL2×10-4mol/L的DPPH溶液加入10 mL比色管中，搖勻，30 min后用提取液作參比，在517 nm處測定吸光度，同時用蒸餾水作參比，測定2 mL 2×10-4mol/L DPPH 溶液的吸光度，根據(jù)下式計算自由基清除率：

式中：A參比為加入蒸餾水時的吸光度；A對照為加入DPPH溶液的體系的吸光度；A樣參為加入不同提取液后的吸光度；A樣品為加入不同提取液+DPPH溶液后體系的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 不同提取溶劑對多酚產(chǎn)率的影響

多酚是植物體內(nèi)一類與蛋白質(zhì)、糖類物質(zhì)等以氫鍵結(jié)合的分子復(fù)合物，而多酚物質(zhì)大多相對分子質(zhì)量大、羥基數(shù)量多，所以提取溶劑不僅需對多酚具有良好的溶解性，而且與多酚更易結(jié)合形成氫鍵，才能最大程度地將植物中的多酚溶出。選擇水、甲醇、不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液、乙酸乙酯、丙酮、氯仿和環(huán)己烷等有機溶劑，在超聲功率320 W、超聲時間30 min、液料比50∶1、超聲溫度50℃條件下進行試驗，提取溶劑對多酚產(chǎn)率的影響見圖1。

注：1.水；2.甲醇；3.乙醇；4.20%乙醇；5.40%乙醇；6.60%乙醇；7.80%乙醇；8.環(huán)己烷；9.乙酸；10.乙酸乙酯；11.丙酮；12.氯仿。

圖1不同提取溶劑對多酚產(chǎn)率的影響

試驗表明，在超聲電磁強化[18]作用下，多酚在水、甲醇、乙醇/水混合極性溶劑體系中有較好的溶解性；乙酸、乙酸乙酯、丙酮次之，幾乎不溶于氯仿、環(huán)己烷。多酚物質(zhì)一般極性較強，因此易溶于水。試驗發(fā)現(xiàn)，對于以縮合單寧為主體的芝麻多酚，體積分?jǐn)?shù)為20%～80%乙醇溶液最適合多酚物質(zhì)的提取。由圖1可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，多酚產(chǎn)率增大，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)80%時，多酚產(chǎn)率有所下降，這可能是因為乙醇體積分?jǐn)?shù)過高使一些脂溶性物質(zhì),如葉綠素等[19]的溶出量也增大，不利于多酚的溶出。故本研究選取體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇溶液提取芝麻粕中多酚。

2.1.2 超聲時間對多酚產(chǎn)率的影響

固定乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、超聲功率240 W、超聲溫度50℃、液料比40∶1，在超聲時間分別為10、20、30、40、50 min下進行試驗，超聲時間對多酚產(chǎn)率的影響如圖2所示。

由圖2可知，隨著超聲時間的延長，多酚產(chǎn)率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，當(dāng)超聲時間為30 min時，多酚產(chǎn)率最大。綜合考慮提取成本與效率，選擇超聲時間為30 min。

圖2 超聲時間對多酚產(chǎn)率的影響

2.1.3 液料比對多酚產(chǎn)率的影響

固定乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、超聲功率240 W、超聲時間30 min、超聲溫度50℃，在液料比分別為20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1下進行試驗，液料比對多酚產(chǎn)率的影響如圖3所示。

圖3 液料比對多酚產(chǎn)率的影響

由圖3可知，當(dāng)液料比小于50∶1時，隨著液料比的增加，多酚產(chǎn)率增大，這是因為增加液料比，傳質(zhì)動力增加，多酚就更容易溶出；當(dāng)液料比大于50∶1時，多酚溶出速率略有所降低。因此，考慮成本與效益，選取液料比為50∶1。

2.1.4 超聲溫度對多酚產(chǎn)率的影響

固定乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、超聲功率240 W、超聲時間30 min、液料比40∶1，在超聲溫度分別為30、40、50、60、70℃下進行試驗，超聲溫度對多酚產(chǎn)率的影響如圖4所示。

圖4 超聲溫度對多酚產(chǎn)率的影響

由圖4可知，超聲溫度對多酚產(chǎn)率的影響呈先上升后下降的趨勢，超聲溫度在30～50℃時，多酚產(chǎn)率隨超聲溫度升高而增加，其原因是隨溫度升高，分子運動加快，導(dǎo)致滲透、擴散、溶解速度加快，化合物更易從細(xì)胞轉(zhuǎn)移到溶劑中；由于植物多酚穩(wěn)定性對溫度變化較敏感[20]，當(dāng)超聲溫度高于50℃時，導(dǎo)致多酚結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，多酚產(chǎn)率下降。因此，選擇超聲溫度為50℃。

2.1.5 超聲功率對多酚產(chǎn)率的影響

固定乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、超聲時間30 min、液料比40∶1、超聲溫度50℃，在超聲功率分別為160、240、320、400 W下進行試驗，超聲功率對多酚產(chǎn)率的影響如圖5所示。

圖5 超聲功率對多酚產(chǎn)率的影響

由圖5可知，當(dāng)超聲功率小于320 W時，隨著超聲功率的增大，多酚產(chǎn)率增大，這是因為超聲功率增強，介質(zhì)質(zhì)點運動加速，使有效物質(zhì)迅速溶出，但超聲功率超過320 W時，多酚產(chǎn)率不再增加。綜合分析，選擇超聲功率為320 W時較為理想。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化芝麻粕中多酚提取工藝

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，綜合考慮各因素對芝麻粕多酚產(chǎn)率的影響，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，選取對多酚產(chǎn)率相對影響較大的超聲功率(A)、超聲溫度(B)、液料比(C)和超聲時間(D)為因素，以多酚產(chǎn)率(Y)為響應(yīng)值，按中心組合試驗設(shè)計原理，設(shè)計四因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗，試驗因素水平及編碼見表1，響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表1 試驗因素水平及編碼

利用Design-Expert V8.0.6軟件對表2試驗數(shù)據(jù)進行方差分析和多元回歸擬合。擬合的多元回歸方程為：Y=2.91-0.25A+0.12B+0.09C-0.053D+0.1AB+0.083AC+0.25AD+0.74BC-0.045BD-0.21CD+0.12A2-0.31B2-0.37C2-0.19D2。回歸模型方差分析見表3。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

表3 回歸模型方差分析

注：P<0.01，影響極顯著；P<0.05，影響顯著。

對回歸方程中4個因素分別求偏導(dǎo)，并令一階導(dǎo)數(shù)等式為零，解方程可得到4個因素的最佳水平值，分別為：A=0.953 8,B=0.481 8,C=0.697 5,D=0.045 5，轉(zhuǎn)換后得到提取的最佳條件為：超聲功率316 W，超聲溫度54℃，液料比57∶1，超聲時間30 min。通過回歸方程計算，多酚產(chǎn)率最大理論值為2.95%。

2.3 芝麻粕中多酚提取優(yōu)化工藝驗證

考慮到生產(chǎn)成本及儀器的可操作性，將優(yōu)化工藝條件校正為：超聲功率320 W，超聲溫度54℃，液料比57∶1，超聲時間30 min。在修正后優(yōu)化條件下進行驗證性試驗(n=3)，多酚產(chǎn)率平均值為2.86%，與理論預(yù)測值相對誤差為3.05%。用Box-Behnken設(shè)計響應(yīng)面法得到的試驗?zāi)Ｐ蛯μ崛≈ヂ槠芍卸喾庸に嚄l件穩(wěn)定可靠。

2.4 芝麻粕多酚提取液對DPPH·的清除作用

DPPH具有較活潑的化學(xué)性質(zhì)，極易形成自由基。在反應(yīng)體系中對DPPH·的清除率越高，表明物質(zhì)的抗氧化能力越強[17]。試驗選擇質(zhì)量濃度相近的食品抗氧化劑叔丁基對苯二酚(TBHQ；CTBHQ=66.00 μg/mL)與芝麻粕多酚提取液(C=65.87 μg/mL)作對比，結(jié)果如圖6所示。

圖6 芝麻粕多酚提取液對DPPH·的清除作用

由圖6可知，芝麻粕多酚提取液及TBHQ對DPPH·的清除率隨著加入量增加而增大，分別加入相同質(zhì)量濃度的芝麻粕多酚提取液和TBHQ，芝麻粕多酚提取液抗氧化能力明顯優(yōu)于TBHQ。這是因為芝麻粕多酚是一個復(fù)雜成分體系[1-5]，其中包括單寧、低相對分子質(zhì)量的酚、黃酮類化合物，甚至糖類和色素。由圖6也可知，當(dāng)DPPH·清除率為50%時，芝麻粕多酚提取液IC50為34.91 μg/mL，TBHQ的IC50為92.40 μg/mL。因此，芝麻粕多酚具有較強抗氧化活性。

3 結(jié) 論

(1)在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以多酚產(chǎn)率為指標(biāo)，選取超聲功率、超聲溫度、液料比及超聲時間4個因素進行中心組合設(shè)計，建立了超聲提取芝麻粕中多酚工藝的數(shù)學(xué)模型：Y=2.91-0.25A+0.12B+0.09C-0.053D+0.1AB+0.083AC+0.25AD+0.74BC-0.045BD-0.21CD+0.12A2-0.31B2-0.37C2-0.19D2。該模型的穩(wěn)定性較好。通過模型顯著性檢驗，得到因素的主效應(yīng)關(guān)系為：超聲功率>超聲溫度>液料比>超聲時間。最佳的工藝條件為以60%乙醇溶液為提取溶劑、超聲功率320 W、超聲溫度54℃、液料比57∶1、超聲時間30 min,在此條件下進行驗證性試驗，多酚產(chǎn)率為2.86%，與理論產(chǎn)率相近。

(2)對比研究了芝麻粕多酚提取液與TBHQ抗氧化能力，芝麻粕多酚提取液清除DPPH·IC50為34.91 μg/mL，TBHQ的IC50為92.40 μg/mL，芝麻粕多酚有較強清除自由基作用，芝麻粕雖然是提取油料的副產(chǎn)物，有望作為天然抗氧化劑和功能性食品而得到開發(fā)利用。