王震雨，張璐妮，邵 玉b，張玉影，陳加俊，劉曉陽(yáng)*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 a.神經(jīng)內(nèi)三科；b.超聲科，吉林 長(zhǎng)春130033；2.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 衛(wèi)生毒理學(xué)教研室)

野黃芩苷，又名燈盞花乙素，來(lái)源于高黃芩的葉，黃芩的莖、葉以及半枝蓮全草等[1]。野黃芩苷可顯著上調(diào)外源性血管生成因子，具備多層次、多靶點(diǎn)的治療優(yōu)勢(shì)，在臨床上作為常用藥普遍應(yīng)用于缺血性疾病[2,3]，但其機(jī)制尚不明確，因此，有必要研究野黃芩苷對(duì)腦缺血再灌注損傷的作用及機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制備

仰臥位固定Wistar大鼠，從頸正中取縱切口長(zhǎng)約2 cm，暴露游離左頸總動(dòng)脈，穿線備用。分離并結(jié)扎同側(cè)頸外動(dòng)脈。結(jié)扎左頸總動(dòng)脈近心端，將尼龍線頭端自結(jié)扎處與分叉間取V形切口輕輕插入，進(jìn)入大腦中動(dòng)脈并阻斷血流。固定尼龍線，記時(shí)，縫合，皮外尼龍線留1 cm。的，缺血1 h后將尼龍線抽出。這時(shí)對(duì)側(cè)的腦血流會(huì)通過(guò)大腦動(dòng)脈交通支來(lái)實(shí)現(xiàn)左側(cè)腦組織的血流再灌注。

1.2 主要試劑

VEGF 抗體( 北京中杉公司)；即用型第二代免疫組化ElivisionTMplus試劑盒(Kit-9901)。

1.3 方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)分組 Wistar雄性大鼠，48只(重270-300 g)，分成4組，缺血再灌注損傷組、缺血再灌注損傷+野黃芩苷低、中、高劑量組(劑量分別為12.5 mg/kg、25 mg/kg、50 mg/kg。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，6只/組用于病理形態(tài)學(xué)和免疫組化檢查。

1.3.2HE染色 取蠟塊制片后，切片脫蠟、水化，蘇木素染色后1%鹽酸乙醇分化，清水沖洗，1%伊紅復(fù)染，常規(guī)行梯度乙醇脫水、二甲苯透明，最后樹脂封片。

1.3.3免疫組織化學(xué)方法 切片常規(guī)脫蠟、水化，PBS沖洗3次，每次3-5 min。應(yīng)用0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液修復(fù)抗原。冷卻后加3%過(guò)氧化氫溶液50 μl，室溫下孵育10 min阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。PBS洗滌3次。除去PBS液后，滴加一抗(兔抗VEGF多克隆抗體)，4℃過(guò)夜。次日PBS沖洗3次，二抗孵育1 h，將切片進(jìn)行顯色，脫水、透明后樹脂封片。24 h后選擇每張切片3個(gè)不同視野，Image-ProPlus軟件分析陽(yáng)性產(chǎn)物吸光度值進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 缺血區(qū)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

對(duì)照組鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：海馬組織的結(jié)構(gòu)明顯發(fā)生異常，細(xì)胞水腫明顯，錐體細(xì)胞排列明顯紊亂，無(wú)明顯的層次結(jié)構(gòu)。細(xì)胞間隙變寬，錐體細(xì)胞的數(shù)目減少?？梢姶罅康蛲黾?xì)胞?？梢娋|(zhì)紅染壞死物質(zhì)和細(xì)胞核固縮、溶解等壞死特征。用藥組海馬組織細(xì)胞缺血性改變程度均輕于對(duì)照組，且隨藥物濃度增加，缺血性改變的減輕程度越明顯。

2.2 缺血區(qū)細(xì)胞VEGF表達(dá)

免疫組化結(jié)果顯示，低劑量組(12.5 mg/kg)、中劑量組(25 mg/kg)、高劑量組(50 mg/kg)各用藥組的腦組織表達(dá) VEGF蛋白表達(dá)是逐漸增高，與空白對(duì)照組比較，高劑量用藥組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 不同濃度野黃芩苷作用后腦缺血損傷組織VEGF蛋白表達(dá)變化

注:與空白對(duì)照組比較，1)P<0.05

3 討論

目前研究關(guān)于單一中藥活性成分的野黃芩苷的資料很少，其對(duì)保護(hù)腦缺血再灌注損傷的作用機(jī)制十分復(fù)雜。腦內(nèi)病理性血管的生成可通過(guò)已分化的血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生增殖、遷移而形成，其為腦缺血性疾病的重要特征之一。張靜等人研究野黃芩苷及其衍生物的神經(jīng)保護(hù)作用和腦靶向性時(shí)發(fā)現(xiàn)： 野黃芩苷及其衍生物均具有保護(hù)腦神經(jīng)的作用，主要是野黃芩苷中的乙酯較其它成份可以明顯通過(guò)血腦屏障，進(jìn)而起到腦神經(jīng)保護(hù)作用[4]。

而本實(shí)驗(yàn)則是利用野黃芩苷，研究其干預(yù)缺血部位腦組織的新血管生成的作用及機(jī)制。 缺血缺氧是血管生成的觸發(fā)因素，腦內(nèi)缺氧時(shí)可以刺激上游的缺氧誘導(dǎo)因子的水平上調(diào)，繼而激活其下游的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子( VEGF)等一系列細(xì)胞因子的表達(dá)，激活血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)而啟動(dòng)新血管生成的過(guò)程[5]。另外，在腦缺血性疾病血管新生過(guò)程中， VEGF作為一種多功能細(xì)胞因子，具有促進(jìn)微動(dòng)脈和小動(dòng)脈血管通透性增加，并使血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生增殖、遷移及誘導(dǎo)血管生成等的作用[6,7]。

本實(shí)驗(yàn)利用結(jié)扎法造模后，應(yīng)用不同濃度野黃芩苷給藥，HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)：用藥組海馬組織細(xì)胞缺血性改變程度均輕于對(duì)照組，且隨藥物濃度增加，缺血性改變的減輕程度越明顯。這說(shuō)明野黃芩苷具有減輕缺血腦組織損傷的作用，并且依賴藥物劑量。而免疫組化結(jié)果顯示，各用藥組腦組織 VEGF蛋白的表達(dá)均明顯增高，與空白對(duì)照組比較，高劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明，野黃芩苷減輕腦缺血損傷的作用主要是促進(jìn)了新血管的生成。但以上實(shí)驗(yàn)還需要進(jìn)一步深入研究來(lái)闡明野黃芩苷抗腦缺血損傷的機(jī)制。