趙 笑，趙愛梅，鄭 喆，羅天淇，楊貞耐*

（北京工商大學(xué)食品學(xué)院，北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京 100048）

隨著乳業(yè)的發(fā)展及奶牛數(shù)量的增加，牛乳中蛋白質(zhì)組成隨之變化，導(dǎo)致原料乳凝乳時間增加，凝乳質(zhì)量變差，甚至出現(xiàn)牛乳不能凝固的情況。在乳制品生產(chǎn)過程中，因牛乳凝乳特性差或不凝乳而導(dǎo)致產(chǎn)品品質(zhì)和產(chǎn)率下降是困擾乳品企業(yè)的突出問題[1]。原料乳的凝乳特性受到多種因素的影響，與奶牛的品種、年齡、胎次、泌乳期、季節(jié)和其他環(huán)境因素等相關(guān)，而這些因素主要通過影響牛乳的組成成分來影響牛乳的凝乳特性[2-3]。

酶凝乳是干酪生產(chǎn)的關(guān)鍵，酶凝乳時間的長短及酶凝乳后的凝膠強(qiáng)度均影響干酪的最終產(chǎn)量及品質(zhì)。合理控制酶凝乳時間可以減少原料乳中脂肪、蛋白質(zhì)等的流失，提高干酪的產(chǎn)率。一般來說，酶凝乳時間相同時，牛乳酶凝乳后凝膠強(qiáng)度越高，表明凝膠中干物質(zhì)含量越高，有利于縮短后期凝乳收縮和壓榨時間，提高干酪產(chǎn)量。酶凝乳的過程不僅受酶本身活性、pH值、加工過程等因素的影響，同時也受原料乳的影響，特別是原料乳中的蛋白組分（主要是κ-酪蛋白（κ-casein，κ-CN））。Ikonen等[4]利用酶凝乳特性不同的原料乳制作Emmental干酪，發(fā)現(xiàn)酶凝乳特性好的原料乳所得到的干酪產(chǎn)率較高，且干酪成熟后品質(zhì)也優(yōu)于酶凝乳特性較差的原料乳制作的干酪。另有研究顯示，由于酶凝乳特性的差異，采用不同原料乳制作的干酪，其成熟后期的風(fēng)味也會受到影響[5]。

牛乳的凝乳特性不僅與牛乳中的總蛋白質(zhì)含量有關(guān)，且與乳蛋白組成存在著遺傳相關(guān)性[6]，而對于牛乳中不同蛋白組分與牛乳凝乳特性間的關(guān)系研究不多。因此，本研究旨在通過在牛乳中添加不同的乳蛋白組分，了解不同乳蛋白組分對牛乳酶凝乳特性的影響；通過分析酶凝乳差異性原料牛乳的差異蛋白組成，探討與酶凝乳相關(guān)的乳蛋白組分，為實(shí)際生產(chǎn)中獲得具有優(yōu)良酶凝乳特性的原料牛乳提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

凝乳酶（食品級） 丹麥科漢森公司；乳清蛋白粉、酪蛋白粉 恒天然（中國）有限公司；α-乳白蛋白（α-lactalbumin，α-La）、β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-LgA和β-LgB）、α-酪蛋白（α-casein，α-CN）、β-酪蛋白（β-casein，β-CN）、κ-CN標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma公司；其他試劑均為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DV-Ⅲ黏度計(jì) 美國Brookfield公司；S-3400N掃描電子顯微鏡 日本日立公司；CGS-3激光光散射儀北京賽普瑞生科技開發(fā)有限責(zé)任公司；Protean IEF Cell等電聚焦儀 美國Bio-Rad公司；LTQ-Orbitrap Velos質(zhì)譜系統(tǒng) 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 不同乳蛋白組分對牛乳酶凝乳特性的影響

1.3.1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

配制質(zhì)量濃度為10 g/100 mL的脫脂牛乳，分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.80%的乳清蛋白濃縮物（whey protein concentrate，WPC）、CN、α-La、β-LgA、β-LgB、α-CN、β-CN和κ-CN，用于研究相同添加量的不同乳蛋白組分對牛乳酶凝乳特性的影響。

將WPC、CN、α-La、β-LgA、β-LgB、α-CN、β-CN和κ-CN標(biāo)準(zhǔn)品配制成相同質(zhì)量濃度（5 mg/mL）的溶液，按100、200、300、400、500 μL/mL的添加量分別加入到脫脂牛乳中，用于研究不同添加量乳蛋白組分對牛乳酶凝乳特性的影響。

1.3.1.2 酶凝乳時間的測定

分別取10 mL添加不同乳蛋白組分的脫脂牛乳樣品，在35 ℃條件下保溫5 min，然后添加100 μL 0.1 mol/L無水氯化鈣和0.002 g/100 mL凝乳酶，并迅速混合均勻，記錄從添加凝乳酶到牛乳開始凝固的時間。

1.3.1.3 凝乳黏度的測定

在25 ℃條件下，利用黏度計(jì)測定添加不同乳蛋白組分的脫脂乳樣品在酶凝乳后的黏度。選用轉(zhuǎn)子型號為SC4-34，設(shè)定轉(zhuǎn)速為100 r/min，剪切速率28 s-1；測定時間1 min，每隔5 s測定1 次，共測定12 次，取12 次測定結(jié)果的平均值作為最終黏度。

1.3.2 凝乳的微觀結(jié)構(gòu)觀察

采用掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，S E M）觀察凝乳的微觀結(jié)構(gòu)。參照H a q u e等[7]的方法，并有所改動。凝乳樣品冷凍干燥后溶解，取5 μL樣品，滴在潔凈的蓋玻片上，于自然條件下干燥，在蓋玻片樣品上滴加50 μL 2.5%、pH 6.8的戊二醛，4 ℃條件下固定3 h；用pH 6.8、0.1 mol/L的磷酸緩沖液清洗3 次，每次10 min；分別用體積分?jǐn)?shù)為30%、50%、70%、80%、90%、100%的乙醇進(jìn)行脫水處理，每次10 min，用100%的乙醇沖洗3 次，其他體積分?jǐn)?shù)的乙醇各1 次，100%乙醇中要加入吸水劑；用醋酸異戊酯對乙醇進(jìn)行置換，每次5 min，共3 次；冷凍干燥后固定需要觀察的面，采用離子漸射的方法鍍金。最后用SEM進(jìn)行觀察。

1.3.3 動態(tài)光散射法測定酶凝乳過程中的酪蛋白分子粒徑

利用NaH2PO4·2H2O和無水Na2HPO4配制0.2 mol/L、pH 8.0的磷酸鹽緩沖溶液，室溫條件下用該緩沖溶液溶解牛乳酪蛋白；將牛乳酪蛋白和各乳蛋白樣品稀釋為質(zhì)量濃度為0.1 g/100 mL的稀薄液體后，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，在無塵條件下裝入樣品瓶待測。檢測方法依據(jù)趙雯等[8]的方法，將樣品瓶置于激光光散射儀樣品室內(nèi)，檢測過程均在90 °角方向進(jìn)行，632.8 nm波長處測定每個樣品的平均流體力學(xué)半徑分布情況。每個樣品測定時間為10 min，以消除低光散射強(qiáng)度對測定的影響。

1.3.4 差異性原料牛乳的差異蛋白分析

1.3.4.1 差異原料牛乳的選擇

本實(shí)驗(yàn)室在2013—2014年期間采集了217 頭荷斯坦奶牛的新鮮原料乳樣品，樣品涵蓋不同季節(jié)、生產(chǎn)胎次和泌乳期的奶牛所產(chǎn)牛乳，并對樣品進(jìn)行乳成分、電導(dǎo)率、pH值及酶凝乳時間的分析[9]，根據(jù)分析結(jié)果，選取蛋白質(zhì)及脂肪含量相同、但酶凝乳時間相差較大的2 個樣品，依據(jù)Valentina等[10]的方法進(jìn)行高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析。

1.3.4.2 雙向電泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE）分析

原料牛乳樣品在4 ℃條件下4 000 r/min離心20 min，去除上層脂肪；經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后放入裂解緩沖溶液中，充分反應(yīng)后置于-20 ℃，待用。使用IPG膠條進(jìn)行等點(diǎn)聚焦，聚焦程序?yàn)椋?0 V，12 h；500 V，1 h；1 000 V，1 h；8 000 V，4 h；2 000 V，10 h。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）參照《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊》[11]中相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行。其中分離膠濃度13.5%，電泳條件為恒流15 mA/塊膠，15 min后加大電流，改為30 mA/塊膠。避光條件下銀染30 min，將脫色并經(jīng)過蒸餾水浸泡的凝膠放入Pharos FX激光成像系統(tǒng)掃描，收集2-DE圖譜，使用PDQuest軟件進(jìn)行圖譜的定量比較分析。

1.3.4.3 差異蛋白質(zhì)譜分析

1）膠內(nèi)酶切、肽段提取

用干凈的解剖刀將差異蛋白點(diǎn)凝膠膠點(diǎn)切成1～2 mm2大小的膠塊放入EP管中；用100 μL 50%乙腈-25 mmol/L碳酸氫銨浸泡膠粒，超聲10 min，棄去溶液，重復(fù)1～2 次至膠粒中藍(lán)色褪盡；真空離心干燥至膠粒完全脫水，加入15 μL 10 ng/μL的胰蛋白酶（用25 mmol/L碳酸氫銨溶解），4 ℃條件下放置30 min，將多余酶液吸走或補(bǔ)充25 mmol/L碳酸氫銨覆蓋膠粒，37 ℃條件下保溫16 h；40 ℃條件下，用100 μL 5%三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）提取1 h，超聲2 次，取上清；30 ℃條件下，用100 μL 2.5% TFA-50%乙腈提取1 h，超聲2 次，取上清，合并2 次上清液，離心干燥。

2）納升級反向色譜-LTQ-Orbitrap Velos軌道阱質(zhì)譜分析儀分析

用20 μL 2%甲醇和0.1%甲酸混合溶液（體積比1∶9）將凍干的多肽復(fù)溶；12 000 r/min離心10 min，取上清上樣（夾心法上樣），上樣體積10 μL；Loading Pump流速350 nL/min，15 min；分離流速350 nL/min，流動相A：0.1%甲酸水溶液；流動相B：0.1%甲酸-乙腈溶液，流動相分離梯度如表1所示；質(zhì)譜母離子掃描范圍為300～1 800m/z，二級碰撞模式為碰撞誘導(dǎo)解離（collision induced dissociation，CID）。

表 1 流動相分離梯度設(shè)置Table 1 Gradient mobile phase composition

3）質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析

本研究中選擇的數(shù)據(jù)庫來自NCBI，數(shù)據(jù)庫版本為Refseq_Bos taurus _201508.fasta，采用Maxquant（Version 1.5.1.2）進(jìn)行搜庫分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳中主要乳蛋白組分對牛乳酶凝乳時間及黏度的影響

2.1.1 不同乳蛋白組分對牛乳酶凝乳時間及黏度的影響

由圖1可知：WPC、κ-CN、β-LgA和β-LgB對牛乳的酶凝乳有促進(jìn)作用，其促進(jìn)作用大小依次為WPC＞β-LgA＞β-LgB＞κ-CN；CN、β-CN、α-CN和α-La對牛乳的酶凝乳有抑制作用，抑制強(qiáng)度依次為α-La＞α-CN＞CN＞β-CN。邢世宇等[12]研究表明，β-Lg對產(chǎn)奶量和乳蛋白組成均有顯著影響，進(jìn)而影響牛乳的凝固特性。由于酶凝乳過程主要是凝乳酶水解κ-CN中苯丙氨酸和蛋氨酸（Phe105-Met106）之間的肽鍵生成副κ-CN和大分子肽鏈，導(dǎo)致酪蛋白膠粒負(fù)電荷的凈數(shù)量和靜電排斥作用下降，引起酪蛋白膠粒發(fā)生聚集，因此牛乳中κ-CN的含量或比例較低，則酶凝乳時間長，凝乳特性較差，相反，添加κ-CN會加快凝乳形成。與本研究不同的是，Wedholm等[13]的研究表明，不僅κ-CN和β-LgB對干酪產(chǎn)率有重要促進(jìn)作用，αS1-CN及β-CN含量較高的原料乳制作的干酪產(chǎn)率也較高，這可能與原料乳本身的蛋白質(zhì)組成差異有關(guān)。Isaya等[14]的研究表明，牛乳本身含有的乳清蛋白可以通過某種競爭性或非競爭性機(jī)制來抑制凝乳酶對κ-CN的水解，并通過形成一定的物理或空間障礙來降低酪蛋白膠束的聚集。本研究中添加乳清蛋白反而縮短了酶凝乳時間，促進(jìn)了酶凝乳；添加酪蛋白則對酶凝乳有一定的抑制作用。這表明牛乳中添加不同的乳蛋白組分可能會影響酪蛋白的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)或酪蛋白膠粒表面的靜電作用，從而影響其最終的聚集狀態(tài)，這與原料乳本身蛋白質(zhì)組分差異引起的酶凝乳特性不同有一定的區(qū)別。

2.1.2 乳蛋白組分含量對牛乳酶凝乳時間及黏度的影響

由表2可知，隨著α-La、α-CN、β-CN或CN添加量的增加，牛乳的酶凝乳時間呈延長趨勢，黏度降低，表明在本研究中，添加上述4 種乳蛋白組分會抑制牛乳的酶凝乳作用，且形成的凝乳塊內(nèi)部結(jié)構(gòu)致密性下降，凝乳質(zhì)量偏差。而隨著β-LgA、β-LgB、κ-CN或WPC添加量的增加，牛乳的酶凝乳時間縮短，黏度增加，表明這4 種乳蛋白組分的添加對酶凝乳具有促進(jìn)作用，且在一定范圍內(nèi)，適當(dāng)增加這些組分的含量可以加快酶凝乳，同時提高凝乳質(zhì)量。張媛等[15]的研究表明，隨著β-CN脫除率的增加，牛乳酶凝乳后的黏性顯著降低，彈性有所上升，凝膠結(jié)構(gòu)疏松，但酶凝乳時間沒有出現(xiàn)明顯滯后，脫除β-CN不影響凝乳酶對κ-CN的降解。Holland等[16]的研究表明，脫除β-CN或乳清蛋白后的牛乳與正常牛乳相比，在酶作用下的凝膠形成時間顯著延長，彈性有所上升。本研究表明，脫除牛乳中某種蛋白組分對酶凝乳質(zhì)量的影響與外源性添加乳蛋白組分有所不同，外源添加β-CN會造成酶凝乳質(zhì)量下降。

表 2 添加不同乳蛋白組分對脫脂牛乳酶凝乳特性的影響Table 2 Effect of adding different milk protein components on the rennet coagulation properties of skim milk

2.2 乳蛋白組分對牛乳酶凝乳微觀結(jié)構(gòu)的影響

由圖2可知：添加β-LgA、β-LgB、κ-CN和WPC的酶凝乳樣品微觀結(jié)構(gòu)連接緊密，形成的空穴較少且分布比較均勻，從而增強(qiáng)了空間穩(wěn)定性，提高了凝乳質(zhì)量；而添加α-La、α-CN、β-CN和CN的酶凝乳樣品微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的改變，凝乳空間結(jié)構(gòu)較疏松，形成的無序空洞結(jié)構(gòu)較多且體積較大，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較差，表現(xiàn)為凝乳質(zhì)量變差。

2.3 乳蛋白組分對酪蛋白膠束凝固行為的影響

圖3為添加不同乳蛋白組分的酪蛋白-酶凝乳體系在酶凝乳形成過程中顆粒分子半徑的分布情況。根據(jù)光散射相關(guān)理論，小分子的半徑變化由于大分子的存在而成為非主導(dǎo)因素，分布曲線中主要體現(xiàn)了大分子半徑的變化。在相同時間段內(nèi)，添加β-LgA、β-LgB、κ-CN和WPC的酪蛋白溶液在加入凝乳酶后，分子半徑分布迅速發(fā)生變化，傾向于集中分布在約100 nm左右（圖3B），表明溶液內(nèi)部的蛋白質(zhì)分子迅速發(fā)生聚集[17]。而添加α-La、α-CN、β-CN和CN的酪蛋白溶液中分子半徑分布比較分散，分布區(qū)間較寬（圖3C）。在凝乳酶催化牛乳凝乳的過程中，酪蛋白膠束中的κ-CN被水解，膠束發(fā)生凝聚。在本研究中，由于用極稀的酪蛋白溶液觀測酶凝乳過程，因此推測蛋白質(zhì)分子半徑未發(fā)生明顯增大的原因是稀釋溶液中蛋白質(zhì)分子間引力不足以形成穩(wěn)定的凝聚結(jié)構(gòu)，仍處于分散狀態(tài)。

2.4 原料乳酶凝乳特性的差異性分析

牛乳中的乳蛋白含量和組成受多種因素的影響，而乳蛋白直接影響牛乳的凝乳特性[18]。為探究原料乳酶凝乳差異與乳蛋白組分之間的關(guān)系，本研究采集蛋白質(zhì)和脂肪含量相近、酶凝乳時間差異顯著（P≤0.05）（表3）的原料牛乳樣品（分別編號為1253和12012）。對酶凝乳特性差異性原料乳樣品進(jìn)行反向HPLC分析。由圖4可知：凝乳質(zhì)量較好的樣品1253中β-CNB和

表 3 酶凝乳特性差異性原料乳的脂肪、蛋白質(zhì)、乳糖含量及酶凝乳時間Table 3 Fat, protein and lactose contents and curding time of raw milk with different coagulation properties

κ-CNA/E的含量明顯高于凝乳質(zhì)量較差的樣品12012；2 個樣品中αS1-CNB/C、β-CNA1和β-LgB的含量沒有明顯差別；樣品12012中存在不同的β-CN變異體。

2.5 原料乳的2-DE差異蛋白圖譜

采用2-DE方法對酶凝乳質(zhì)量差異性乳樣進(jìn)行比較分析。由圖5可知，乳樣中的主要蛋白質(zhì)組分為αS1-CN、αS2-CN、β-CN、κ-CN和β-Lg，凝乳較差的樣品12012中存在較多的變異體。已有研究表明，α-La對牛乳酶凝乳特性具有顯著影響，而在本研究中蛋白質(zhì)印記未顯示出差異，這可能是由于差異原料乳中不同基因型的α-La含量接近[19]。

2.6 質(zhì)譜分析結(jié)果

對既有的乳蛋白2-DE圖譜進(jìn)行比較，識別出組分有差異的同種蛋白質(zhì)進(jìn)行深入比較，通過LTQ-Orbitrap Velos質(zhì)譜對2-DE分析得到的差異蛋白數(shù)據(jù)進(jìn)行搜庫，識別出多個肽段信息。

表 4 酶凝乳特性差異性原料乳樣品中的差異蛋白比較分析Table 4 Comparison of differential proteins in different milk samples

由表4可知，牛乳中的差異蛋白質(zhì)均與奶牛的生理活動和代謝機(jī)能相關(guān)。屬于κ-CN的差異蛋白質(zhì)影響磷脂酰肌醇3-激酶的合成及活性以及蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)功能；屬于αS2-CN的差異蛋白質(zhì)包括3 組：第1組差異蛋白質(zhì)影響相關(guān)基因表達(dá)及能量轉(zhuǎn)換過程；第2組差異蛋白質(zhì)影響細(xì)胞增殖及凋亡和蛋白質(zhì)的合成及能量轉(zhuǎn)化；第3組差異蛋白質(zhì)主要影響結(jié)構(gòu)分子活性，其中角蛋白與奶牛表皮發(fā)育情況有關(guān)。β-CN的差異蛋白質(zhì)包括2 組：第1組差異蛋白質(zhì)影響細(xì)胞膜的組成和蛋白質(zhì)修飾：第2組差異蛋白質(zhì)影響酰基鞘氨醇葡糖轉(zhuǎn)移酶活性和DNA的翻譯。奶牛乳腺上皮細(xì)胞具有合成和分泌乳汁的特殊功能，包括乳中脂肪和蛋白質(zhì)等成分的合成和調(diào)控[20-21]。乳腺上皮細(xì)胞是乳成分生成過程中重要的物質(zhì)和能量轉(zhuǎn)化場所，而質(zhì)譜分析結(jié)果所涉及的細(xì)胞功能與乳腺上皮細(xì)胞的生理功能緊密相關(guān)。對于產(chǎn)凝乳特性較差牛乳的奶牛，其牛乳蛋白質(zhì)成分中含有較多的磷脂酰肌醇3-激酶前體和囊泡結(jié)合蛋白前體，其他差異蛋白質(zhì)則含量較少。磷脂酰肌醇3-激酶[22]是一種與細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)有關(guān)的脂類第二信使，能抑制多種急性細(xì)胞應(yīng)答，與多種生物學(xué)事件有關(guān)，如囊泡運(yùn)輸、細(xì)胞骨架重組、細(xì)胞存活及細(xì)胞凋亡等，這些活性蛋白質(zhì)可能對牛乳的生成及分泌產(chǎn)生一系列復(fù)雜的影響，從而導(dǎo)致牛乳酶凝乳特性的差異。

3 結(jié) 論

牛乳中乳蛋白組分種類及含量對牛乳酶凝乳特性具有不同程度的影響。添加WPC、κ-CN、β-LgA和β-LgB可在一定程度上促進(jìn)酶凝乳，且在一定范圍內(nèi)，添加量與凝乳質(zhì)量成正比；而α-La、α-CN、β-CN和CN的添加則對酶凝乳有一定的抑制作用。酶凝乳微觀結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果表明，添加WPC、κ-CN、β-LgA和β-LgB可以使酶凝乳微觀結(jié)構(gòu)更加緊密。采用動態(tài)光散射法測定酶凝乳過程中酪蛋白分子粒徑的分布情況，發(fā)現(xiàn)酪蛋白溶液中添加WPC、κ-CN、β-LgA和β-LgB后，再加入凝乳酶，酪蛋白分子半徑分布迅速發(fā)生變化，蛋白質(zhì)分子趨于聚集。采用2-DE和質(zhì)譜鑒定分析確定出6 組差異蛋白，其中3 組屬于αS2-CN、2 組屬于β-CN、1 組屬于κ-CN，各差異蛋白組分與奶牛體內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)、能量轉(zhuǎn)化、酶的合成及蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等的生物活性有關(guān)，不同的生理活性對牛乳的生成及分泌產(chǎn)生一系列復(fù)雜的影響，從而導(dǎo)致牛乳酶凝乳特性的差異。