農(nóng)雪萍　黃建華　馮雅莉　劉翼軍

【摘要】 目的：探索外泌體β-actin mRNA作為惡性胸腔積液和結(jié)核性胸腔積液鑒別診斷指標的臨床價值。方法：收集70例結(jié)核性胸腔積液和57例惡性胸腔積液，采用外泌體沉淀試劑沉淀胸腔積液中的外泌體后用Trizol法提取外泌體總RNA，之后通過微滴式數(shù)字定量PCR技術(shù)檢測外泌體中β-actin mRNA的表達。結(jié)果：數(shù)字定量PCR結(jié)果顯示，1 ?g結(jié)核性胸腔積液外泌體總RNA中β-actin的拷貝數(shù)為75.20（15.15，614.00），1 ?g惡性胸腔積液外泌體總RNA中β-actin的拷貝數(shù)為4.65（1.95，22.40），兩組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.02）。受試者工作特征曲線結(jié)果顯示，曲線下面積為0.79±0.04（P<0.000 1）。結(jié)論：外泌體β-actin mRNA可作為惡性胸腔積液和結(jié)核性胸腔積液鑒別診斷的潛在的新指標。

【關(guān)鍵詞】 惡性胸腔積液 結(jié)核性胸腔積液 外泌體 β-actin mRNA

Application Value of Exosome β-actin mRNA in Differential Diagnosis of Malignant Pleural Effusion and Tuberculous Pleural Effusion/NONG Xueping， HUANG Jianhua， FENG Yali， LIU Yijun. //Medical Innovation of China， 2019， 16（29）： -172

[Abstract] Objective： To explore if β-actin could be used as a novel method to distinguish malignant pleural effusion from tuberculous pleural effusion using the levels of β-actin mRNA in exosomes. Method： A total of Seventy cases of tuberculous pleural effusion and 57 cases of malignant pleural effusion were collected. After the exosomes in pleural effusion were precipitated by exosomes precipitation reagent， total exosomes RNA was extracted by Trizol method， the expression of beta-actin mRNA in exosomes was detected by microdrop quantitative PCR. Result： The results of quantitative PCR showed that the copy number of actin in the total RNA of 1 μg tuberculous pleural effusion exosomes was 75.20 （15.15， 614.00）， and that of 1 μg malignant pleural effusion exosomes was 4.65 （1.95， 22.40）， showed statistically significant difference between the two groups （P=0.02）.The results of the subject operating characteristic curve show that the area under the curve was （0.79±0.04） （P<0.000 1）. Conclusion： Exosome beta-actin mRNA may be a potential new indicator in the differential diagnosis of malignant pleural effusion and tuberculous pleural effusion.

[Key words] Malignant pleural effusion Tuberculous pleural effusion Exosome β-actin mRNA

First-authors address： Jiangxi Chest Hospital， Nanchang 330006， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.29.044

胸腔積液是一種由多種病因引起的臨床常見疾病。對于胸腔積液的診斷有助于原發(fā)病因的明確、患者預(yù)后的判斷以及治療方案的選擇[1]。結(jié)核性胸腔積液和惡性胸腔積液是我國最常見的兩種胸腔積液類型[2]，但是正確的區(qū)分兩種類型并不容易，因為兩者均可出現(xiàn)胸痛、發(fā)熱、消瘦、乏力等相似的臨床表現(xiàn)，而且均屬于滲出性胸腔積液，且均可為血性積液。雖然胸腔積液中查到結(jié)核分枝桿菌或腫瘤細胞可明確診斷，但是臨床實踐中發(fā)現(xiàn)單次胸腔積液的陽性檢出率較低，需進行3次以上的送檢。即使如此，仍然有一部分病例經(jīng)過多種無創(chuàng)檢測仍無法明確診斷，對于這部分病例只有行胸腔鏡檢查方能提高診斷準確度[3-4]。但是胸腔鏡檢查為有創(chuàng)檢查，對操作者技能和經(jīng)驗要求較高，且有不可忽視的禁忌證和并發(fā)癥，因此不能常規(guī)運用于臨床區(qū)分結(jié)核性胸腔積液和惡性胸腔積液[5]。外泌體是一種由細胞釋放出的具有雙層脂質(zhì)的細胞外囊泡，其直徑為30～150 nm，包含了其來源細胞豐富且特異的miRNA、mRNA、DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和其他生物活性分子等物質(zhì)，因此可以通過檢測外泌體內(nèi)的特異性物質(zhì)來明確其來源細胞的類型[6-8]。目前外泌體內(nèi)包含的來源細胞特異性mRNA已被報道可用于糖尿病腎病、膀胱癌、結(jié)直腸癌和前列腺癌等疾病的診斷[9-12]。β-actin是一種常見的內(nèi)參基因，其在不同類型的組織和細胞穩(wěn)定表達[13]。本文就外泌體β-actin mRNA在胸腔積液和惡性胸腔積液鑒別診斷中的臨床價值進行研究，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年12月-2018年6月到本院就診的123例患者，其中結(jié)核性胸腔積液患者70例，結(jié)核性胸腔積液組納入標準：（1）胸腔積液及組織中涂片找到結(jié)核分枝桿菌或者培養(yǎng)有結(jié)核分枝桿菌生長;（2）組織病理標本PCR檢測陽性或符合干酪性肉芽腫病變;（3）胸腔積液PCR檢測陽性或影像學(xué)表現(xiàn)符合結(jié)核病;（4）符合結(jié)核病臨床過程，同時結(jié)核菌素試驗陽性（硬結(jié)平均直徑>20 mm）;（5）診斷性抗結(jié)核治療2個月，臨床表現(xiàn)和影像學(xué)特點都有好轉(zhuǎn)。符合（1）、（2）任一項;或（3）、（4）、（5）中的至少兩項均可入組。排除標準：（1）有心、肝、腎等嚴重疾病和精神病;（2）合并惡性腫瘤、自身免疫性疾病、糖尿病;

（3）妊娠期、哺乳期婦女;（4）人免疫缺陷病毒（HIV）檢測抗體陽性者。惡性胸腔積液患者57例，惡性胸腔積液組納入標準：（1）胸腔積液細胞沉淀中找到惡性細胞;（2）胸膜活檢組織中觀察到惡性腫瘤的病理改變。符合（1）或（2）任一項均可入組。排除標準：妊娠期、哺乳期、HIV感染、急性病毒感染、自身免疫性疾病及免疫抑制劑應(yīng)用史、嚴重肝腎功能損害者。該研究獲得醫(yī)院倫理委員會的批準，所有患者均知情同意。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣本收集及處理 收集經(jīng)呼吸科科確診的結(jié)核性胸腔積液和惡性胸腔積液各5 mL裝入1.5 mL離心管（貨號：430791，美國Corning公司），于冷凍離心機（型號：5810R，德國Eppendorf公司）中4 ℃ 3 000×g離心15 min。用0.22 μm一次性針頭式濾器（貨號：SLGP033RB，德國Merck公司）抽濾上清液，將抽濾后的液體裝入5 mL凍存管，-80 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 外泌體沉淀及總RNA提取

1.2.2.1 外泌體沉淀 將凍存的樣本取出后放入37 ℃水浴鍋中完全融解后立即取出，吸取500 μL樣本于1.5 mL EP管中，加入126 μL ExoQuick外泌體沉淀劑（貨號：EXOQ5A-1，加拿大SBI公司）后放入4 ℃冰箱孵育至少12 h以上。孵育完成后冷凍離心機中4 ℃ 1 500×g離心30 min，取出EP管，棄上清，其底部的團塊狀白色物質(zhì)即為沉淀的外泌體。

1.2.2.2 總RNA提取 用62.6 μL無酶去離子水重懸外泌體團塊，之后采用Trizol法提取外泌體總RNA。具體過程如下：（1）外泌體懸液中加入1 mL Trizol（貨號：15596026，美國ThermoFisher公司），室溫放置5 min;（2）加入200 μL氯仿，充分振蕩混勻后冰浴放置15 min;（3）4 ℃ 12 000×g離心15 min后吸取上層水相于2 mL無酶EP管中;（4）加入500 μL預(yù)冷異丙醇后充分混勻，冰浴放置10 min;（5）4℃ 12 000×g離心15 min，棄上清，加入1 mL無酶去離子水配制的75%乙醇，顛倒混勻;（6）4 ℃ 8 000×g離心15 min，盡量棄上清，室溫開蓋干燥5～10 min;（7）用20 μL無酶去離子水溶解RNA;（8）用NanoPhotometer（型號：N60，德國IMPLEN公司）檢測RNA的濃度及純度。

1.2.3 β-actin mRNA表達的檢測

1.2.3.1 總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 使用iScript cDNA合成試劑盒（貨號：1708891，美國Bio-Rad公司）將1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20 μL：5×反應(yīng)混合物4 μL，逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL，無酶去離子水和RNA模板量根據(jù)各樣本RNA濃度確定。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：首先25 ℃ 5 min使引物與模板結(jié)合，然后46 ℃ 20 min進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，接著95 ℃ 1 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，最后4 ℃保存。

1.2.3.2 微滴式數(shù)字PCR檢測 β-actin上游引物序列為5‘-CAGAGCAAGAGAGGCATC-3，下游引物序列為5‘-CTGGGGTGTTGAAGGTCT-3，擴增片段長度為216 bp。PCR擴增體系為20 μL：2×EvaGreen擴增混合物（貨號：1864034，美國Bio-Rad公司）10 μL，前引物100 nM，后引物100 nM，cDNA 1 μL，無酶去離子水8.8 μL。擴增條件：95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s高溫變性，60 ℃ 1 min退火/延伸，40個循環(huán);4 ℃ 5 min;90 ℃

5 min。具有檢測步驟如下：（1）將20 μL PCR擴增體系和70 μL微滴發(fā)生油分別加入微滴發(fā)生板，微滴發(fā)生儀（型號：QX200，美國Bio-Rad公司）將自動生成微滴;（2）將生成的微滴全部加入微滴式數(shù)字PCR專用96孔板內(nèi)進行擴增，并設(shè)置陰性對照;（3）擴增結(jié)束后將96孔板放入微滴讀取儀（型號：QX200，美國Bio-Rad公司）中進行檢測，QuantaSoft軟件將自動計算每個檢測樣本所含目的基因的拷貝數(shù)。

1.2.4 臨床診斷的評價 將結(jié)核性胸腔積液組β-actin mRNA表達設(shè)為對照組，惡性胸腔積液組β-actin mRNA表達設(shè)為疾病組，以靈敏度為縱坐標，1-特異度為橫坐標繪制受試者工作特征曲線（ROC曲線），計算曲線下面積，評價其臨床診斷價值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 定量資料使用SPSS 11.0軟件，運用k-s方法檢驗數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，若為正態(tài)分布則用均數(shù)+標準差表示，若為非正態(tài)分布則用中位數(shù)（四分位間距）表示。兩組數(shù)據(jù)比較根據(jù)數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布采用非配對t檢驗或Mann-Whitney U檢驗，統(tǒng)計分析均使用GraphPad Prism 7.0軟件，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者的一般資料比較 惡性胸腔積液組，非小細胞肺癌30例，腺癌：男28例，女23例，鱗癌：男2例;小細胞癌2例，其中乳腺癌1例，卵巢癌1例。兩組患者的性別、年齡、病程比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性，見表1。

2.2 外泌體總RNA濃度及純度 500 μL結(jié)核性胸腔積液和惡性胸腔積液所獲得的外泌體總RNA濃度和純度比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表2。

2.3 兩組樣本β-actin微滴式數(shù)字PCR檢測結(jié)果比較

2.3.1 兩組樣本微滴數(shù)量檢測結(jié)果 123個胸腔積液樣本及陰性對照樣本微滴數(shù)量均達到了10 000個以上，部分樣本微滴數(shù)量結(jié)果見圖1。

2.3.2 兩組樣本β-actin表達結(jié)果 微滴式數(shù)字PCR結(jié)果顯示，所有檢測樣本陰性微滴的熒光信號值均值為2 494.04±65.94。微滴式數(shù)字PCR自帶分析軟件QuantaSoft自動設(shè)置檢測閾值為8 000，結(jié)核性胸腔積液中有陽性微滴的例數(shù)為66例，惡性胸腔積液中有陽性微滴的例數(shù)為50例，兩組陽性微滴檢出率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.34）。設(shè)置檢測閾值后QuantaSoft軟件自動計算出20 ?L PCR擴增體系中β-actin的拷貝數(shù)，根據(jù)此結(jié)果計算出1 ?g結(jié)核性胸腔積液外泌體總RNA和1 ?g惡性胸腔積液外泌體總RNA中β-actin的拷貝數(shù)分別為75.20（15.15，614.00）和4.65（1.95，22.40），兩組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.02），見圖2。

2.4 β-actin診斷價值的評估 ROC曲線下面積為（0.79±0.04），95%CI為（0.71，0.87），與曲線下面積等于0.5相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.000 1），見圖3。ROC曲線顯示當診斷臨界值為0.3時，具有最高的診斷靈敏度92.86%，特異度為10.71%;當診斷臨界值為2 618時，具有最高的診斷特異度100%，此時靈敏度為11.43%;當診斷臨界值為258時，具有最高的似然比，其值為18.4，此時診斷的靈敏度為32.86%，特異度為98.21%。

3 討論

胸腔積液的診斷步驟首先要按照Light氏標準明確其為漏出液還是滲出液，之后如果是滲出液的話根據(jù)相關(guān)病史進行對應(yīng)的實驗室檢查和特殊檢查，例如如果需要對最不容易區(qū)分的結(jié)核性和惡性胸腔積液進行鑒別的話，則需要進行胸腔積液細胞計數(shù)、生化、腫瘤標志物檢查、PPD檢查、多次涂片查找抗酸桿菌或者腫瘤細胞、微生物培養(yǎng)、多次胸膜活檢甚至可能需要開胸肺活檢，整個診斷過程非常的繁瑣、耗時，因此臨床急需無創(chuàng)、準確、快速的新診斷方法輔助醫(yī)生明確病因以便為患者提供最及時的醫(yī)療處理[3，14]。

最近研究表明外泌體是一種新的疾病診斷標志物，它由所有類型的細胞分泌至體液中，每種細胞分泌的外泌體內(nèi)所包含的生物分子各有不同，同一種細胞所分泌的外泌體也會隨著該細胞狀態(tài)的不同而有所不同，因此可通過檢測相關(guān)體液中所包含的外泌體的特征來明確其來源細胞或者反映其來源細胞的狀態(tài)，從而達到疾病診斷的目的[15]。外泌體表面高表達的CD317和表皮生長因子受體被認為是非小細胞肺癌的診斷標志物，外泌體內(nèi)miR-483-5p、miR-200b-5p等miRNA的高表達也被報道對于肺腺癌的診斷有臨床價值[16]。

外泌體mRNA同樣是一種具有潛力的疾病診斷生物標志物。尿液外泌體Wilms瘤基因1的mRNA的高表達與糖尿病腎病的不良預(yù)后相關(guān)[8]，尿液外泌體SLC2A1、GPRC5A和KRT17基因mRNA高表達有望成為膀胱癌的潛在生物標志物[10]。因此筆者認為胸腔積液中外泌體mRNA也有成為輔助胸腔積液

診斷的指標之一。目前檢測mRNA表達最常用的方法為熒光實時定量PCR技術(shù)相對定量法，該方法通過獲得同一樣本目的基因和內(nèi)參基因的閾值循環(huán)數(shù)，用目的基因閾值循環(huán)數(shù)/內(nèi)參基因循環(huán)數(shù)的比值來表示樣本中目的基因的表達，因此內(nèi)參基因的選擇極其重要[17]。β-actin和GAPDH是檢測mRNA相對表達最常用的內(nèi)參基因，文獻[8]研究中選用的內(nèi)參基因即為GAPDH，但是目前尚未見將β-actin作為內(nèi)參基因的報道。本課題組在前期的胸腔積液外泌體相關(guān)研究的預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn)外泌體中β-actin的mRNA表達在結(jié)核性胸腔積液和惡性胸腔積液中的差異較大，結(jié)核性胸腔積液外泌體中β-actin的mRNA表達顯著高于惡性胸腔積液，因此筆者推測胸腔積液外泌體中的β-actin mRNA也許可以作為一個新的鑒別診斷指標，因此增加了樣本量，并對其診斷價值進行了評價。

微滴式數(shù)字PCR法是通過用微滴發(fā)生油將PCR反應(yīng)體系處理成上萬個油包水微滴，每個油包水微滴即成為一個獨立的PCR擴增系統(tǒng)，PCR擴增完成后微滴讀取儀讀取所有微滴中的熒光信號，軟件即可自動計算出樣本中目的基因的拷貝數(shù)，理論上可以檢出含有1個拷貝的目標分子[18]。本研究中通過微滴式數(shù)字PCR法檢測了1 ?g結(jié)核性和惡性胸腔積液外泌體總RNA中β-actin的拷貝數(shù)，結(jié)果顯示少部分樣本外泌體中并不能檢測到β-actin的表達;結(jié)核性胸腔積液外泌體中β-actin的表達顯著高于惡性胸腔積液中的表達，其原因可能與結(jié)核桿菌抗菌抗原刺激巨噬細胞后，巨噬細胞的分泌改變有關(guān)，但是其具體的機制仍不清楚[19-20]。

綜上所述，外泌體β-actin mRNA具有作為結(jié)核性胸腔積液和惡性胸腔鑒別診斷新指標的潛力，其確切的臨床診斷價值需進行多中心大樣本量的驗證，且在實際應(yīng)用時其診斷臨界值的選擇取決于臨床的實際需要。

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（收稿日期：2019-04-15） （本文編輯：張爽）