朱曉東， 張佳佳， 郭玉婷， 蘭 衛(wèi)

(1烏魯木齊市中醫(yī)醫(yī)院， 烏魯木齊 830000； 新疆醫(yī)科大學(xué)2克拉瑪依學(xué)院， 新疆 克拉瑪依 834099； 3中醫(yī)學(xué)院， 烏魯木齊 830011)

意大利牛舌草為紫草科意大利牛舌草(AnchusaitalicaRetiz)或琉璃苣(Borageofficinalis)的干燥地上部分[1,2]，主要化學(xué)成分為揮發(fā)油、三萜、黃酮等化合物[2]，具有抗腫瘤、抗氧化、抗病毒等功效，臨床上多用于抑郁癥、高血壓、肺炎及結(jié)核疾病的治療[3]。本研究采用大鼠動(dòng)脈血栓模型和正常小鼠模型，探究意大利牛舌草提取物抗血栓及抗氧化作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1儀器AL204型電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)， UV-2550型紫外光譜儀(日本島津公司)，BCD-238W型冰箱 (中國(guó)海爾有限公司)，微量移液槍(上海玻利鴿儀器有限公司)。

1.2試劑復(fù)方氯化鈉注射液(國(guó)藥集團(tuán)新疆制藥有限公司，批號(hào) H65020068)，F(xiàn)eCl3(成都市臨江化工廠，批號(hào)XK-001-2002101)，水合氯醛(武漢市和盛化工有限公司，批號(hào)1005412)，阿司匹林腸溶片(拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號(hào)J20130078)，超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定試劑盒，丙二醛(MDA)測(cè)試盒，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶，(GSH-PX)測(cè)試盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.3藥材意大利牛舌草2017年2月購(gòu)于新疆維吾爾藥業(yè)有限公司(批號(hào)20160518)，經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院資源教研室盛萍教授鑒定為紫草科植物意大利牛舌草(AnchusaitalicaRetiz)的干燥地上部分。

1.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF昆明種小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量(20.0±2.0)g；Wistar大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量(200.0±20.0)g，購(gòu)于新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(新)2011-0004。

2 方法

2.1藥材的提取方法將意大利牛舌草陰干后粉碎，稱取5.0 kg粗粉2份置于容器中，分別加入蒸餾水、70%乙醇回流提取，提取液濃縮后得到意大利牛舌草水提物932 g，意大利牛舌草醇提物浸膏563 g。

2.2動(dòng)物的分組及給藥方法取健康昆明小鼠70只，隨機(jī)分為7組(n=10)，正常對(duì)照組小鼠給予等體積蒸餾水，意大利牛舌草水提物高(678.40 mg/kg)、中(339.20 mg/kg)、低(169.60 mg/kg)劑量組，意大利牛舌草乙醇提物高(409.50 mg/kg)、中(204.75 mg/kg)、低劑量組(102.38 mg/kg)，小鼠每天灌胃給藥1次，連續(xù)灌胃21 d。

2.3意大利牛舌草提取物的抗氧化作用末次給藥24 h后，將小鼠摘除眼球取血，脫頸處死，室溫靜置2 h后放于冰箱4℃下3 h，待血液凝固血塊收縮后，3 500 r/min離心15 min，取上層黃色血清于試管中，按試劑盒方法說(shuō)明書(shū)測(cè)定小鼠血清中的SOD、MDA、GSH-PX含量。

2.4意大利牛舌草提取物對(duì)小鼠凝血時(shí)間(CT)的影響取健康昆明種小鼠40只，隨機(jī)分為4組，正常對(duì)照組給予等體積蒸餾水，陽(yáng)性對(duì)照組灌服阿司匹林(80 mg/kg)，意大利牛舌草醇提物組(204.75 mg/kg)，意大利牛舌草水提物組(339.20 mg/kg)，各組小鼠每天灌胃1次，連續(xù)灌胃14 d，于末次給藥1 h后，用玻璃毛細(xì)管插入小鼠眼內(nèi)眥后靜脈叢中4～5 mm，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，自血液流入毛細(xì)管內(nèi)開(kāi)始計(jì)時(shí)，待血液注滿后，輕輕取出，每隔30 s折斷毛細(xì)管約0.5 cm，觀察折斷處是否有血凝絲，至血凝絲出現(xiàn)為止，所用時(shí)間即為CT。

2.5意大利牛舌草提取物對(duì)小鼠止血時(shí)間(BT)的影響按“2.4”項(xiàng)下方法將小鼠分組、灌胃給藥，給藥1 h后，用利剪將距小鼠尾尖0.5 cm處剪斷，從血液自行溢出時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，每隔30 s用濾紙片吸去血滴1次，直至出血自然停止(濾紙吸時(shí)無(wú)血)，所用時(shí)間即為BT。

2.6意大利牛舌草提取物對(duì)大鼠體內(nèi)動(dòng)脈血栓形成的影響取Wistar大鼠24只，隨機(jī)分成4組，正常對(duì)照組給予等體積蒸餾水，陽(yáng)性對(duì)照組灌服阿司匹林(80 mg/kg)，意大利牛舌草醇提物組(141.75 mg/kg)，意大利牛舌草水提物組(234.83 mg/kg)。末次給藥前禁食不禁水12 h，灌胃給藥1 h后，用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉, 將大鼠固定于鼠臺(tái)，分離右頸總動(dòng)脈,用塑料薄膜片隔開(kāi)動(dòng)脈與周圍的組織,將濾紙剪成1 cm×1 c m的濾紙片，用35%的FeCl3浸潤(rùn),包裹動(dòng)脈20 min后，取出包裹處動(dòng)脈段內(nèi)的血栓，放在濾紙上，吸干血液，用電子天秤準(zhǔn)確稱量血栓濕重，并用千分尺準(zhǔn)確測(cè)量血栓長(zhǎng)度，計(jì)算血栓抑制率，血栓抑制率/% =(對(duì)照組血栓重量-給藥組血栓重量)/對(duì)照組血栓重量×100%。

3 結(jié)果

3.1意大利牛舌草對(duì)小鼠抗氧化作用研究與正常對(duì)照組比較，意大利牛舌草醇提物高劑量組小鼠血清中SOD、GSH-PX活性升高， MDA含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；意大利牛舌草醇提物中、低劑量組小鼠血清中SOD、GSH-PX活性升高， MDA含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與正常對(duì)照組比較，意大利牛舌草水提物高、中、低劑量組小鼠血清中SOD、GSH-PX活性升高，而使MDA含量降低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 意大利牛舌草提取物對(duì)小鼠血清中SOD、MDA、GSH-PX的影響

注：與正常對(duì)照組比較,*P<0.05，**P<0.01。

3.2意大利牛舌草提取物對(duì)正常小鼠凝血、止血時(shí)間的影響與正常對(duì)照組比較，意大利牛舌草醇提物組小鼠凝血時(shí)間延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；意大利牛舌草水提物組小鼠凝血時(shí)間延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；意大利牛舌草醇提物組和意大利牛舌草水提物小鼠止血時(shí)間均延長(zhǎng)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

3.3意大利牛舌草提取物對(duì)大鼠體內(nèi)動(dòng)脈血栓形成的影響與正常對(duì)照組比較，意大利牛舌草醇提物組大鼠血栓濕重降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；意大利牛舌草水提物組大鼠血栓濕重降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。陽(yáng)性對(duì)照組血栓抑制率為45.09%，意大利牛舌草醇提物血栓抑制率為42.76%，意大利牛舌草水提物血栓抑制率為36.68%，見(jiàn)表3。

表2 意大利牛舌草提取物對(duì)正常小鼠凝血、止血時(shí)間的影響

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

表3 意大利牛舌草提取物對(duì)大鼠體內(nèi)動(dòng)脈血栓形成的影響

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

4 討論

血栓的形成與血管內(nèi)皮損傷、血小板數(shù)量和活性、血液凝固性、抗凝活性、血液流變性異常等因素有關(guān)，是一個(gè)復(fù)雜的生理、生化及病理過(guò)程[4,5]。當(dāng)機(jī)體內(nèi)血管壁有損傷，凝血活性升高，血小板粘附、聚集性增強(qiáng)，血流速度緩慢，血液粘度增強(qiáng)時(shí)，就容易形成血栓[6]。凝血時(shí)間是觀察藥物對(duì)機(jī)體凝血機(jī)制有無(wú)影響的重要指標(biāo)，主要受機(jī)體凝血因子的含量、功能以及血液中凝血因素、抗凝血因子活性的影響。目前有多種動(dòng)脈血栓模型的建模方法，本研究采用FeCl3誘導(dǎo)建立大鼠頸總動(dòng)脈血栓模型，其原理是利用FeCl3損傷血管壁，使血管內(nèi)膜受損，從而激活血小板和凝血系統(tǒng)，在損傷局部形成阻塞性血栓[7]。該建模方法簡(jiǎn)單、易控制、重復(fù)性好，通過(guò)損傷血管壁內(nèi)皮細(xì)胞而引起的血栓，更接近于臨床上自發(fā)性血栓的組織形態(tài)特征。研究表明自由基與人類大部分常見(jiàn)疾病的發(fā)生有關(guān)，如心腦血管疾病、癌癥的發(fā)生都與自由基有著密切的關(guān)系[8-9]。根據(jù)自由基學(xué)說(shuō)理論，當(dāng)機(jī)體衰老時(shí)，抗氧化系統(tǒng)抗氧化能力下降，自由基代謝產(chǎn)物增加，進(jìn)而加速機(jī)體衰老,因此提高抗氧化酶的活性，降低自由基代謝產(chǎn)物的生成，是延緩衰老的重要途徑[10-13]。本研究發(fā)現(xiàn)意大利牛舌草提物可抑制血栓形成，改善機(jī)體抗氧化能力，減少機(jī)體氧化損傷而發(fā)揮防治心血管疾病的作用，但其確切的藥理作用機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。