阿米熱·艾則孜， 李晨陽， 胡 旭， 徐 芳， 趙 軍

(1新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 烏魯木齊 830011； 2新疆藥物研究所維吾爾藥重點實驗室， 烏魯木齊 830004)

黑種草子為毛茛科(Ranunculaceae)黑種草屬1年生草本植物瘤果黑種草(Nigellaglandulifera.)的干燥成熟種子，又名腺毛黑種草，在我國新疆大部分地區(qū)都有種植，藥材資源豐富[1]。研究表明，黑種草子的主要化學(xué)成分為皂苷、黃酮和生物堿類化合物等，其中黑種草皂苷A(NigegllanosideA)是該藥材中含量最高的水溶性成分[2-3]，具有抗氧化、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜、健腦補(bǔ)腎、活血通經(jīng)等藥理作用，臨床上常用于健忘耳鳴、乳少經(jīng)閉等病癥的治療[4-5]。本課題組前期考察了黑種草總皂苷的最佳提取工藝[6]，但對黑種草皂苷A(NigegllanosideA)的提取工藝研究未見報道。本研究以單因素實驗為基礎(chǔ)，結(jié)合響應(yīng)面分析法對黑種草皂苷A的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1儀器AL-204型電子天平(上海市梅特勒托利多-儀器有限公司)，Agilent 1260型高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)，AS10200ADT型超聲玻璃清洗器(天津市奧特賽恩斯儀器有限公司)，OSB-2011型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海市愛朗儀器有限公司)，HF-105A型高速多功能粉碎機(jī)(永康市辰禾盛豐工貿(mào)有限公司)。

1.2試藥黑種草皂苷A對照品(新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所植化室制備，純度>98%)，乙腈(美國Fisher公司,批號:A959-4，色譜純)，無水乙醇(山東佰仟化工有限公司，批號:10009218，分析純)，硫酸銨 (廣東翁江化學(xué)試劑有限公司，批號:PA01080 ，分析純)。

1.3藥材黑種草子藥材2017年11月購于安徽亳州藥材市場，經(jīng)新疆藥物研究所何江副研究員鑒定為瘤果黑種草(Nigellaglandulifera.)的干燥成熟種子。

2 方法

2.1黑種草皂苷A的含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱Agilent Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相:乙腈-水(28∶72)，柱溫30℃，波長210 nm，流速1.0 mL/min。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 稱取黑種草皂苷A對照品10.06 mg，加甲醇稀釋成濃度為1.006 mg/mL的溶液。分別量取黑種草皂苷A對照品溶液各0.1、0.5、1.0、2.0、4.0置于5 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻。分別吸取黑種草皂苷A系列對照品溶液10 μL，按“2.1.1”項下色譜條件測定，記錄峰面積，以對照品溶液濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程：Y=1 471.4X-2.428 6(R2=0.999 9)，黑種草苷A在0.021～1.006 mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3 供試品溶液的制備 取黑種草子粉碎,過40目篩，稱取粉末1.0 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入乙醇-硫酸銨雙水相適量，靜置1 h，超聲提取30 min，濾過，濾液置分液漏斗中靜置分層，取上層乙醇相清液，蒸干，甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，定容，即得。

[式中:Y為樣品濃度(mg/mL)；X為定容體積(mL)；m為稱取樣品的質(zhì)量(mg)]

2.2單因素試驗以黑種草皂苷A的提取率為指標(biāo)，固定其他條件，依次改變料液比(m∶v，1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50)、硫酸銨用量(m/v，0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 g/mL)、乙醇濃度(30%、40%、50%、60%、70%)和超聲時間(10、20、30、40、50 min)進(jìn)行測定。

2.3Box-Behnken響應(yīng)面試驗選擇料液比、硫酸銨用量和乙醇濃度為主要影響因素，黑種草皂苷A提取率為指標(biāo)，設(shè)計了3因素3水平的響應(yīng)面分析實驗，見表1。

表1 響應(yīng)面的影響因素水平表

3 結(jié)果

3.1單因素考察

3.1.1 料液比對黑種草皂苷A提取率的影響 當(dāng)料液比為1∶40，提取率最高，因此確定料液比為1∶40，見圖1。

3.1.2 硫酸銨用量對提取率的影響 當(dāng)硫酸銨濃度達(dá)到0.35 g/mL時，提取率達(dá)到最大，因此確定硫酸銨用量為0.35 g/mL，見圖2。

3.1.3 乙醇濃度對提取率的影響 當(dāng)乙醇濃度為50%時，提取率增加的趨于平穩(wěn)，結(jié)合乙醇濃度對提取率的影響，因此確定乙醇濃度為50%，見圖3。

3.1.4 超聲時間對提取率的影響 當(dāng)超聲時間為30 min時提取率最高，超聲時間越長，雙水相的穩(wěn)定性越差，從而影響黑種草皂苷A的提取效果，因此確定超聲時間為30 min，見圖4。

3.2響應(yīng)面實驗設(shè)計與數(shù)據(jù)結(jié)果

3.2.1 響應(yīng)面實驗設(shè)計 在單因素的基礎(chǔ)上，選擇料液比、硫酸銨用量和乙醇濃度進(jìn)行 3因素 3 水平共計17個實驗點的響應(yīng)面分析實驗，見表2。

3.2.2 響應(yīng)面實驗數(shù)據(jù) 以黑種草皂苷A的提取率為響應(yīng)值，采用Design-Expert軟件對試驗中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，建立二次響應(yīng)面回歸模型如下：Y=3.01-0.021A-0.094B-0.18C-0.12AB+0.20AC-0.23BC-0.47A2-0.17B2-0.34C2(R2=0.945 7)。表明該實驗?zāi)Ｐ蛿M合度良好，能夠描述所選因素與響應(yīng)值的關(guān)系。對模型進(jìn)行方差分析，由F值大小可以判斷，各因素對黑種草皂苷A提取率的影響大小順序為：C>B>A，即乙醇濃度>硫酸銨用量>料液比，見表3。

3.2.3 響應(yīng)面實驗設(shè)計結(jié)果 由各因素交互作用影響的響應(yīng)面圖及其等高線圖關(guān)系顯示，位于橢圓區(qū)域中心的點為黑種草皂苷A提取率最高點，由中心向周圍邊緣呈逐漸降低趨勢，處于同一橢圓型曲線上的黑種草皂苷A提取率相同。交互項AC和BC交互明顯，而AB項交互作用不顯著。根據(jù)模型優(yōu)化的最佳提取條件為料液比1∶39.30，硫酸銨用量0.35 g/mL，乙醇濃度47.35%?？紤]到實際操作條件，對模型優(yōu)化的工藝條件進(jìn)行修正：料液比1∶ 39，硫酸銨用量0.35 g/mL，乙醇濃度47%。按照此條件進(jìn)行驗證實驗，3次平行實驗所得黑種草皂苷A的提取率實測平均值為3.15%，RSD為1.91%。模型預(yù)測值為3.04%，實測值與預(yù)測值的相對誤差為2.59%，基本一致。最佳提取工藝條件為為：料液比1∶39，硫酸銨用量0.35 g/mL，乙醇濃度47%，見圖5～7。

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計表

表3 響應(yīng)面二次模型的方差分析表

注：*P<0.05為差異不顯著,**P<0.01為差異顯著。

3.3驗證實驗稱取100 g黑種草子，按照修正的優(yōu)化工藝條件進(jìn)行驗證實驗，結(jié)果3次平行實驗所得黑種草皂苷A提取率的平均值為3.15%，RSD為1.9%。模型預(yù)測值為3.04%，實測值與預(yù)測值的相對誤差為2.59%，說明理論的最佳提取工藝有效可行。

4 討論

皂苷類化合物易溶于水、乙醇、甲醇等的溶劑 ，難溶于乙醚、石油醚等親脂性溶劑[7]，常用的提取方法有水煎煮[8]、滲漉法[9]、回流法[10]、浸漬法[11]等。雙水相萃取法是指在一定的條件下，具有親水性的聚合物與水混合后形成兩相溶液，利用被分離化合物在兩相中分配的差異而達(dá)到分離[12]，該技術(shù)具有萃取條件溫和、分相快速、成本低、操作簡單、無溶劑殘留、操作可連續(xù)化等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于天然活性成分的規(guī)?；a(chǎn)中[13]。已有研究報道采用響應(yīng)面法對雙水相提取工藝進(jìn)行優(yōu)化[14,15]。本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化雙水相提取黑種草皂苷A的工藝，方法操作簡單、穩(wěn)定可行，適用于黑種草皂苷A的提取。