王春梅，夏安婷，鄭宜文，李慶章，高學(xué)軍，張莉

（乳品科學(xué)教育部重點實驗室東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，哈爾濱150030）

0 引言

目前我國飼養(yǎng)的大部分奶牛都是中國荷斯坦奶牛及其雜交牛，中國荷斯坦奶牛是我國培育的第一個奶牛品種，經(jīng)過30多年的改良，在遺傳穩(wěn)定性與適應(yīng)能力上都有了很大的提高，但是與我國現(xiàn)代奶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展要求相比牛奶品質(zhì)仍有待提高[1]。過去幾十年，在對影響奶牛乳產(chǎn)量及乳品質(zhì)的研究中，人們主要將視線集中在奶牛多條泌乳信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面，而對表觀遺傳學(xué)的研究極少涉足。隨著泌乳機制研究的深入，研究者們漸漸意識到表觀遺傳學(xué)也有參與泌乳調(diào)控過程的可能。目前為止，國際上關(guān)于表觀遺傳學(xué)中的DNA甲基化的研究多針對于癌癥領(lǐng)域[2，3]，而奶牛泌乳相關(guān)的研究非常少。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的典型事件，是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNM Ts)的作用下引入一個甲基（-CH3）修飾5’-Cp G-3’的胞嘧啶，甲基化修飾后可以直接阻止轉(zhuǎn)錄因子進入并識別結(jié)合基因啟動子，從而抑制基因轉(zhuǎn)錄[4]。本實驗室在分析不同泌乳品質(zhì)（高乳品質(zhì)和低乳品質(zhì)）奶牛的泌乳相關(guān)基因的啟動子的甲基化狀態(tài)時發(fā)現(xiàn)泌乳相關(guān)基因的啟動子的甲基化狀態(tài)在高乳品質(zhì)和低乳品質(zhì)泌乳奶牛中存在明顯差異，提示DNA甲基化可能參與了泌乳調(diào)控。本實驗以健康的泌乳期中國荷斯坦奶牛的乳腺上皮細胞為實驗?zāi)Ｐ?，通過研究DNA去甲基化藥物5-雜氮脫氧胞苷（5-Aza）對奶牛乳腺上皮細胞中m TOR基因蛋白表達水平的影響，試圖從DNA甲基化方面揭示影響奶牛乳品質(zhì)差異的原因，進一步完善奶牛泌乳的分子機制，為我國目前乳品行業(yè)發(fā)展中面臨的困難的有效解決提供更豐富的理論依據(jù)，對生產(chǎn)實際及科學(xué)理論都有著極其重要的意義。

1 材料和方法

1.1 奶牛乳腺上皮細胞的分離培養(yǎng)與鑒定

采取消化法（膠原酶Ⅳ，Sigm a）體外分離得到原代奶牛乳腺上皮細胞（BM ECs），使用含有10%血清（胎牛血清，Canada）和青、鏈霉素的DF12培養(yǎng)液（DM EM-F12培養(yǎng)液，H yclone）貼壁培養(yǎng)于5%CO2、37℃條件下。分離純化后，采用免疫熒光染色法對細胞進行角蛋白18染色鑒定，按前人所述[5]。使用FITC標記的熒光二抗標記角蛋白18，DAPI標記細胞核。

1.2 5-Aza作用奶牛乳腺上皮細胞的條件

實驗前1d將細胞均勻接種于6孔板中，并保持生長狀態(tài)和生長密度均為一致。第2 d分別向6孔板中添加藥物。對照組：10μg/mL催乳素、5μg/mL胰島素；5-Aza處理組：0.1μmol/mL 5-Aza、10μg/mL催乳素、5μg/mL胰島素。

1.3 5-Aza對奶牛乳腺上皮細胞活性的影響分析

5-Aza處理細胞48 h后，消化收集以上2組實驗細胞，在裝有10 mL CASY?ton的CASY?杯加入100μL細胞懸液（對細胞懸液進行1000倍稀釋），顛倒混勻，進行3次測量，每次的測量體積為200μL，檢測細胞活性。

1.4 mTOR與β-酪蛋白的蛋白表達量檢測

0.1μmol/m L 5-Aza處理細胞48h后收取細胞蛋白樣品，采用western blotting技術(shù)檢測m TOR蛋白與β-酪蛋白的表達差異。藥物作用48 h后收取細胞蛋白樣品，使用SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒配制凝膠，按說明書操作。濕轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)膜時間90 min。一抗mTOR單克隆抗體（Santa Cruz）、β-酪蛋白（Santa Cruz）、二抗HRP-山羊抗兔IgG（北京 中杉金橋）。使用Sag Capture對蛋白條帶進行掃描，使用imagine Pro-plus6.0讀取蛋白灰度值。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行分析，本實驗所有試驗重復(fù)3次，定量數(shù)據(jù)結(jié)果采用平均數(shù)±標準差來表示，組間比較用單因素方差分析，組內(nèi)比較用t檢驗并對多組進行了單因素方差分析。P〈0.05有統(tǒng)計學(xué)意義，P〈0.01具有統(tǒng)計學(xué)極顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 奶牛乳腺上皮細胞的分離培養(yǎng)與鑒定

采用細胞免疫熒光染色法檢測分離純化的奶牛乳腺上皮細胞的角蛋白18的表達，結(jié)果顯示（圖1）細胞的細胞核被DAPI染為藍色，角蛋白18為熒光綠色，說明分離純化培養(yǎng)的細胞為奶牛乳腺上皮細胞。

2.2 5-Aza對奶牛乳腺上皮細胞活性的影響

圖1 奶牛乳腺上皮細胞角蛋白18的鑒定（100×）

本實驗采用所在實驗室前期已經(jīng)確定的5-Aza作用于奶牛乳腺細胞的最優(yōu)濃度的0.1μmol/mL進行試驗[6]。為了進一步驗證0.1μmol/mL 5-Aza是否會對奶牛乳腺上皮細胞的正?；钚援a(chǎn)生影響，5-Aza處理細胞48 h后，本實驗進一步使用CASY細胞活力儀測定了5-Aza對奶牛乳腺上皮細胞活性的影響，結(jié)果如圖2所示與對照組相比，0.1μmol/mL 5-Aza對奶牛乳腺上皮細胞的細胞活力影響不大（P〉0.05），進一步確認可以以此濃度作為實驗濃度。

圖2 5-Aza對奶牛乳腺上皮細胞的細胞活力的影響

2.3 mTOR蛋白的Western blotting檢測結(jié)果

5-Aza處理細胞48 h后，分別收取細胞蛋白樣品，使用Western blotting技術(shù)分別檢測對照組和加藥處理組的奶牛乳腺上皮細胞中m TOR蛋白的表達變化情況（圖3）。結(jié)果可見在0.1μmol/L 5-Aza作用下奶牛乳腺上皮細胞m TOR蛋白表達明顯高于空白對照組，差異性極顯著（P〈0.01）。

圖3 5-Aza處理后m TOR蛋白的表達量顯著高于對照組

2.4 β-酪蛋白的Western blotting檢測結(jié)果

5-Aza處理細胞48 h后，分別收取細胞蛋白樣品，使用Western blotting技術(shù)分別檢測對照組和加藥處理組的奶牛乳腺上皮細胞中β-酪蛋白的表達變化情況（見圖4）。結(jié)果可見在0.1μmol/L 5-Aza作用下，奶牛乳腺上皮細胞β-酪蛋白的表達明顯高于空白對照組，差異性極顯著（P〈0.01）。

圖4 5-Aza處理后β-酪蛋白的蛋白表達檢測

3 討論

奶牛的表觀遺傳學(xué)的相關(guān)研究目前剛剛起步，DNA甲基化參與泌乳的生物學(xué)調(diào)控機制還需進一步深入研究。DNA甲基化是在保持DNA原有序列的基礎(chǔ)上調(diào)控基因表達的一種可遺傳的基因表觀修飾方式，常見于哺乳動物基因組的啟動子區(qū)[7]。本實驗室在分析產(chǎn)乳品質(zhì)不同的奶牛乳腺組織的基因啟動子甲基化水平差異時，發(fā)現(xiàn)與泌乳相關(guān)的六個重要基因的啟動子甲基化水平均顯示出顯著差異，且DNA甲基化水平與乳品質(zhì)成負相關(guān)，表明DNA甲基化可能參與了泌乳調(diào)控[8]。Liu等[9]人的實驗結(jié)果也呈現(xiàn)出了相似的結(jié)果，在不同的泌乳時期，EEF1D基因的甲基化水平也表現(xiàn)出了明顯差異。DNA甲基化是一個可逆的過程，在環(huán)境變化和生物發(fā)育過程中，哺乳動物體內(nèi)甲基化的形成與去除往往處于動態(tài)調(diào)節(jié)的狀態(tài)。DNA的去甲基化可以由去甲基化酶主動完成，也可以通過DNA甲基化酶的失活或缺失而被動實現(xiàn)[10]。Frank lyn等人證實5-Aza能通過抑制胰島素、皮質(zhì)醇和催乳素而影響乳腺分化[11]。Plachot[12]等在人乳腺上皮細胞中，添加甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-雜氮-2-脫氧胞嘧啶，結(jié)果顯示乳腺上皮細胞的分化程度降低。5-Aza的化學(xué)結(jié)構(gòu)類似于Cp G二核苷酸，兩者會形成競爭關(guān)系，結(jié)果導(dǎo)致DNA啟動子的甲基化水平下降，所以可使細胞的相關(guān)基因甲基化水平受到抑制。所以，本實驗也采用5-Aza作用于奶牛乳腺細胞，抑制細胞的DNA甲基化水平進行試驗，研究DNA甲基化水平對泌乳關(guān)鍵通路關(guān)鍵蛋白m TOR的表達的影響以及對奶牛泌乳功能的影響。

近年來的研究還表明，營養(yǎng)物質(zhì)、能量和激素通過PI3K/AKT/m TOR通路對蛋白質(zhì)翻譯的調(diào)控可能是決定奶牛乳腺上皮細胞乳蛋白生成的重要因素[13-14]。mTOR信號通過級聯(lián)整合營養(yǎng)和內(nèi)分泌信號，改變翻譯起始因子4E（eIF4E）結(jié)合蛋白1（4E-BP1）、轉(zhuǎn)錄因子和核糖體蛋白S6激酶（S6K1）的表達水平和磷酸化狀態(tài)從而對乳蛋白的合成起作用[15-16]。本實驗從全基因組甲基化水平研究了5-Aza對泌乳關(guān)鍵通路關(guān)鍵蛋白m TOR的表達的影響，發(fā)現(xiàn)m TOR的表達與DNA甲基化水平成極顯著的負相關(guān)，類似的實驗結(jié)果在神經(jīng)干細胞[17]與肝癌細胞[18]中也有發(fā)現(xiàn)。本實驗結(jié)果還證明體外條件下5-Aza能顯著提高奶牛乳腺上皮細胞中β酪蛋白的表達水平。β-酪蛋白是乳蛋白的主要成分，也是體外泌乳功能研究的標志之一[19]，其表達與m TOR呈正相關(guān)關(guān)系[20]。不同的激素與氨基酸比例對m TOR的表達及乳蛋白的合成都有著影響，已有的研究表明m TOR能夠促進乳蛋白的合成[21]。本實驗結(jié)果提示5-Aza可能可以通過影響m TOR或其上游蛋白基因的啟動子的甲基化狀態(tài)影響m TOR蛋白的表達水平，最終影響β-酪蛋白的表達水平，影響奶牛乳腺細胞的泌乳功能，進一步表明DNA甲基化也參與了奶牛泌乳調(diào)控。本研究從表觀遺傳學(xué)角度探討了奶牛泌乳調(diào)節(jié)機制，為改善奶牛牛奶質(zhì)量、提高牛奶產(chǎn)量研究，促進我國乳制品行業(yè)的發(fā)展提供了一個新的研究思路。