汪超，李阜爍，林文珍，陸文昊，范夢(mèng)珠，陳平，洪志駿，張少輝，

（1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海200240；2.浙江熊貓乳業(yè)集團(tuán)股份有限公司，浙江溫州325800；3.浙江輝肽生命健康科技有限公司,浙江溫州325800）

0 引言

牛乳中含有豐富的蛋白質(zhì)，這些蛋白被分解后產(chǎn)生的多肽具有多種生物活性，包括抗菌性、抗氧化性、免疫調(diào)節(jié)活性、抗高血壓、抗炎癥、抗衰老等[1-4]。牛乳蛋白中酪蛋白的占比達(dá)到80%，是乳源性多肽的重要來(lái)源，以其作為底物能夠得到很多具有不同生物活性的多肽[5-8]。

目前，乳源性多肽的制取方法主要有兩種：通過(guò)乳酸菌發(fā)酵制備，或利用胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等消化酶進(jìn)行酶解制備[9-10]。瑞士乳桿菌屬于水解性能較強(qiáng)的乳酸菌，在其發(fā)酵過(guò)程中能夠產(chǎn)生豐富的多肽[8,11,12]。

本文結(jié)合乳酸菌發(fā)酵和蛋白酶水解兩種方法，通過(guò)菌酶協(xié)同的發(fā)酵方式，以多肽產(chǎn)量為考察指標(biāo)，選擇胃蛋白酶、復(fù)合胰蛋白酶、酸性蛋白酶3種不同的酶作為輔助酶制劑，用瑞士乳桿菌CICC6024作為發(fā)酵菌種，研究了發(fā)酵時(shí)間、酶用量、發(fā)酵溫度三個(gè)因素對(duì)酪蛋白源多肽制備的影響，并通過(guò)Box-Behnken響應(yīng)面法對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，為酪蛋白源多肽的生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與試劑

MRS培養(yǎng)基，酪蛋白，乳糖、胃蛋白胨Peptone（來(lái)源于酪蛋白），瑞士乳桿菌（CICC 6024），酸性蛋白酶（酶活力1×105U/g），胃蛋白酶（酶活力4×105U/g），復(fù)合胰蛋白酶（酶活力2×105U/g），氯化鈉（N aC l），等。

1.2 儀器與設(shè)備

3 ku超濾管，JB-VS-1300U超凈工作臺(tái)，LRH-250F生化培養(yǎng)箱，GI36T高壓滅菌鍋，F(xiàn)rom a 700低溫冰箱，RO 15純水系統(tǒng)，GL-22M高速冷凍離心機(jī)，Tecan Infinite M200 PRO酶標(biāo)儀。

1.3 方法

1.3.1 瑞士乳桿菌的純化

取少量瑞士乳桿菌C ICC 6024菌粉，接種到M RS液體培養(yǎng)基中，于37℃下培養(yǎng)24 h。用M RS培養(yǎng)基，將菌液進(jìn)行梯度稀釋后，取合適濃度菌液于MRS瓊脂培養(yǎng)基上（瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.4%）涂布培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h至長(zhǎng)出明顯的菌落。挑取單菌落至M RS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行富集培養(yǎng)，繼續(xù)活化3次后使用和保存。

1.3.2 酶溶液的制備

根據(jù)酸性蛋白酶、胃蛋白酶、復(fù)合胰蛋白酶不同酶活性，分別稱取0.5，0.125，0.25 g酶制劑；溶于10 mL滅菌RO水，配制得到酶活力為5 000 U/mL的酶溶液，依次通過(guò)0.45μm濾膜、0.22μm濾膜進(jìn)行過(guò)濾除菌，得到酶溶液待用，每次現(xiàn)制現(xiàn)用。

1.3.3 發(fā)酵液的制備

按實(shí)驗(yàn)室之前的研究成果[13]，最適的酪蛋白培養(yǎng)液成分為8%酪蛋白、6%乳糖、0.5%N aCl（均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)），最適pH值為6.5，按此條件配置酪蛋白培養(yǎng)液，(95±1)℃殺菌5 min，冰水浴冷卻至(37±1)℃。其后接種活化菌液，接種量為6%（體積分?jǐn)?shù)），并按比例加入酶溶液，37℃靜置發(fā)酵得發(fā)酵液，（95±1）℃水浴加熱5 min滅酶，冰水浴快速冷卻，4℃冷藏待用。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參考文獻(xiàn)[14]中的方法，采用Folin-酚法測(cè)定多肽濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

稱取N a2CO3為1 g，N aOH為0.2 g，酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O6·4 H2O）為0.025 g，充分溶解于RO水中，定容至50 mL，即為A液；稱取0.05 g硫酸銅（Cu-SO4·5H2O）溶解于RO水中，定容至10 m L，即為B液，A液和B液于4℃冰箱中保存。A液和B液以體積比50∶1混合，即得到試劑甲，每次現(xiàn)配現(xiàn)用。

稱取Peptone 150 m g，充分溶解于RO水中，定容至50 m L，配制成濃度為3 mg/m L的標(biāo)準(zhǔn)肽溶液。用RO水及標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成質(zhì)量濃度分別為0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 g/L的肽溶液。分別吸取以上各質(zhì)量濃度的肽溶液30 uL于96孔板中，設(shè)置5個(gè)平行。每孔加入150 uL試劑甲，迅速振蕩，于室溫下（20～25℃）靜置10 min，再逐孔加入15 uL試劑乙（Fo lin-酚試劑），立即混勻，室溫下避光靜置30 min。用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔中溶液500 nm處的吸光值（OD500），以肽濃度為橫坐標(biāo)，OD500值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 多肽的提取

取10 m L發(fā)酵液，在8 800 g（4℃低溫條件下）離心30 min，棄沉淀取上清。得到的上清液用3 ku超濾膜超濾，超濾離心條件為2 500 g，4℃，30 min；收集底部超濾液即得到混合多肽溶液，保存于4℃冰箱中待用。

1.3.6 多肽質(zhì)量濃度的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[14]中的方法，并做了適當(dāng)修改，具體步驟如下。對(duì)混合肽溶液進(jìn)行5倍、10倍稀釋，取各稀釋液用1.3.4中所述方法測(cè)定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算肽質(zhì)量濃度，其計(jì)算為

式中：C為實(shí)際多肽液質(zhì)量濃度；C0為多肽稀釋液測(cè)定所得質(zhì)量濃度；N為稀釋因子。

1.3.7 蛋白酶的篩選

選擇酸性蛋白酶、復(fù)合胰蛋白酶、胃蛋白酶3種蛋白酶進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在接種瑞士乳桿菌的同時(shí)加入蛋白酶溶液，接種量6%(體積分?jǐn)?shù))，蛋白酶用量20 U/m L，37℃發(fā)酵24 h，期間每隔2 h取1次樣品，進(jìn)行多肽質(zhì)量濃度的檢測(cè)。

1.3.8 單因素實(shí)驗(yàn)

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果篩選確定最佳蛋白酶后，在蛋白酶用量20 U/m L，發(fā)酵溫度37℃的條件下，研究發(fā)酵時(shí)間（0，2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24 h）對(duì)多肽產(chǎn)量的影響；在發(fā)酵時(shí)間8 h，發(fā)酵溫度37℃的條件下，研究蛋白酶用量（0，20，40，60，80，100，120，140，160 U/m L）對(duì)多肽產(chǎn)量的影響；在發(fā)酵時(shí)間8 h，蛋白酶用量60 U/m L的條件下，研究發(fā)酵溫度（31，34，37，40，43℃）對(duì)多肽產(chǎn)量的影響。確定最佳單因素。

1.3.9 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)，以多肽產(chǎn)量為指標(biāo)，確定最佳工藝參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 多肽質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

邢美孜等人對(duì)Fo lin-酚法做出了針對(duì)性的改良，使其更適用于多肽濃度的測(cè)定。研究了多肽濃度測(cè)定用標(biāo)準(zhǔn)曲線的最適標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，對(duì)BSA、胰蛋白酶降解產(chǎn)物Tryptone和胃蛋白酶降解產(chǎn)物Peptone三種物質(zhì)進(jìn)行比較分析后，確定了Peptone為最佳標(biāo)準(zhǔn)物[14]。參考其方法繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 多肽濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

回歸方程為y=0.0604x+0.0073，R2=0.9916。由此可知，Peptone質(zhì)量濃度在0～3.0 g/L之間時(shí)，其質(zhì)量濃度與吸光度之間具有較好的線性關(guān)系。因此，將該曲線作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的多肽濃度測(cè)定用標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2 蛋白酶的篩選

胃蛋白酶、復(fù)合胰蛋白酶是酶解法制備乳源生物活性肽的常用蛋白酶[9,15]，故選擇該兩種酶進(jìn)行菌酶協(xié)同發(fā)酵試驗(yàn)。另外，考慮到菌酶協(xié)同發(fā)酵時(shí)的特殊環(huán)境，培養(yǎng)液的pH值會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷降低，故又選擇添加了酸性蛋白酶進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)。

菌酶協(xié)同發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵時(shí)間和不同的蛋白酶對(duì)多肽產(chǎn)量的影響如圖2所示。從結(jié)果可以看出，發(fā)酵時(shí)間在6 h以內(nèi)時(shí)，胃蛋白酶組、酸性蛋白酶組和不加酶組的多肽產(chǎn)量差異不大，胰蛋白酶組多肽產(chǎn)量較高，但和8 h處的多肽產(chǎn)量相比，仍有較大差距。說(shuō)明在發(fā)酵初期，不同蛋白酶的加入對(duì)多肽產(chǎn)量的影響均不大。這個(gè)結(jié)果可能與蛋白酶的適宜pH值有關(guān)，培養(yǎng)液的初始pH值為6.5，該條件下胰蛋白酶活性較強(qiáng)，酸性蛋白酶活性不強(qiáng)，而胃蛋白酶基本無(wú)活性。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間超過(guò)6 h之后，各實(shí)驗(yàn)組的多肽產(chǎn)量均快速提高，8 h之后，酸性蛋白酶組多肽產(chǎn)量明顯優(yōu)于其他三組，故選擇酸性蛋白酶用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)多肽質(zhì)量濃度的影響

由圖2可知，發(fā)酵初期多肽產(chǎn)量變化不大，發(fā)酵時(shí)間超過(guò)6 h后，多肽產(chǎn)量出現(xiàn)明顯增加，8～24 h之間，多肽產(chǎn)量呈現(xiàn)出上下波動(dòng)的趨勢(shì)。在16 h處多肽產(chǎn)量達(dá)最高值，質(zhì)量濃度為（6.10±0.20）g/L，但統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，其與8，14，18 h三個(gè)時(shí)間的多肽產(chǎn)量均無(wú)顯著性差別（P＞0.05）。

這可能是由于在瑞士乳桿菌與蛋白酶的協(xié)同發(fā)酵過(guò)程中，瑞士乳桿菌的發(fā)酵作用是主要因素，外源蛋白酶只起到輔助作用。前期瑞士乳桿菌的增殖處于遲緩期，培養(yǎng)液酸度不夠，故而多肽產(chǎn)量變化不大，6 h后進(jìn)入瑞士乳桿菌的對(duì)數(shù)期，多肽產(chǎn)量出現(xiàn)快速提高。這與Ahtesh[16]等人在研究Flavourzym e與幾種益生菌的協(xié)同發(fā)酵時(shí)得到的結(jié)果類似。后期多肽濃度出現(xiàn)波動(dòng)可能是由于多肽被瑞士乳桿菌吸收利用所導(dǎo)致的。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合生產(chǎn)效率的考量，確定發(fā)酵8 h為最佳發(fā)酵時(shí)間，此時(shí)多肽產(chǎn)量為（5.77±0.14）g/L。

圖2 不同蛋白酶及發(fā)酵時(shí)間對(duì)多肽產(chǎn)量的影響

2.3.2 酶用量對(duì)多肽質(zhì)量濃度的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，不同劑量的酸性蛋白酶都有助于提高多肽產(chǎn)量，最佳蛋白酶用量為60 U/m L，此條件下，多肽產(chǎn)量為（6.19±0.19）g/L。當(dāng)酸性蛋白酶用量較少，在20～60 U/m L之間時(shí)，多肽產(chǎn)量隨著酶用量的提高而增加；當(dāng)用量高于60 U/m L后，多肽產(chǎn)量呈現(xiàn)出波動(dòng)下降的趨勢(shì)。這可能是因?yàn)樯倭康耐庠葱运嵝缘鞍酌改軌蛱岣呷鹗咳闂U菌菌群的生理活性，促進(jìn)多肽的產(chǎn)生。而過(guò)多的外源性蛋白酶會(huì)破壞菌群自身產(chǎn)生的蛋白酶系[17]，影響瑞士乳桿菌的生理活動(dòng)，使多肽產(chǎn)量下降。

圖3 蛋白酶用量對(duì)多肽產(chǎn)量的影響

2.3.3 發(fā)酵溫度對(duì)多肽質(zhì)量濃度的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)酵溫度對(duì)多肽產(chǎn)量影響較大。隨著溫度的提高，多肽產(chǎn)量呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)溫度達(dá)到37℃時(shí)，多肽產(chǎn)量達(dá)到最高，為（6.18±0.10）g/L。值得注意的是，當(dāng)發(fā)酵溫度為40℃時(shí)，多肽產(chǎn)量下降并不明顯，隨著溫度的繼續(xù)升高，多肽產(chǎn)量出現(xiàn)較大幅度的下降。這可能是由于40℃下瑞士乳桿菌的活性比37℃時(shí)更強(qiáng)，菌體繁殖更快，但發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的多肽被進(jìn)一步降解和利用，以滿足菌體自身的營(yíng)養(yǎng)需求[18-19]，所以多肽產(chǎn)量出現(xiàn)小幅下降。而當(dāng)溫度持續(xù)上升后，超過(guò)菌體的適宜生長(zhǎng)溫度，多肽產(chǎn)量開(kāi)始明顯下降。

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)多肽產(chǎn)量的影響

由單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，酸性蛋白酶與瑞士乳桿菌協(xié)同發(fā)酵的最佳條件為：發(fā)酵時(shí)間8 h，酸性蛋白酶用量60 U/m L，發(fā)酵溫度37℃。以此結(jié)果為基礎(chǔ)，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化產(chǎn)肽工藝參數(shù)

2.4.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，采用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，以發(fā)酵時(shí)間（X1）、酶用量（X2）、發(fā)酵溫度（X3）為自變量，以多肽產(chǎn)量為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表1所示。

采用Design-Expert 8.0.6對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到的回歸方程為

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

具體分析結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ头讲罘治?/p>

由表2可以看出，回歸方程模型顯著性檢測(cè)P〈0.0001，極顯著，表明該回歸方程模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；失擬項(xiàng)P=0.8202〉0.05，差異不顯著，表明擬合情況良好，未知因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響較小。該模型的確定系數(shù)R2=0.9845，調(diào)整系數(shù)R2Adj=0.9646，說(shuō)明該模型能解釋96.46%響應(yīng)值的變化，擬合度較好，試驗(yàn)誤差較小，可以用此模型對(duì)多肽產(chǎn)量進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。由顯著性檢驗(yàn)可知，一次項(xiàng)X1，X2，X3；交互項(xiàng)為X2X3；平方項(xiàng)為X21和X23均為極顯著；交互項(xiàng)為X1X2和X1X3；平方項(xiàng)X22為不顯著。

2.4.2 響應(yīng)面分析與條件優(yōu)化

發(fā)酵時(shí)間、酶用量、發(fā)酵溫度三個(gè)因素之間交互作用的響應(yīng)面和等高線如圖5-圖7所示。

圖5 發(fā)酵時(shí)間和蛋白酶用量的響應(yīng)面和等高線圖（X 3=37℃）

圖6 發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度的響應(yīng)面和等高線圖（X2=60 U/m L）

圖7 發(fā)酵溫度和蛋白酶用量的響應(yīng)面和等高線圖（X1=8 h）

由圖5可以看出，發(fā)酵溫度固定為37℃時(shí)，多肽產(chǎn)量隨著酶用量的增加而不斷提高，發(fā)酵時(shí)間小于8 h時(shí)，增長(zhǎng)較快，而當(dāng)發(fā)酵時(shí)間超過(guò)8 h后，多肽產(chǎn)量的增長(zhǎng)趨勢(shì)減緩；隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，多肽產(chǎn)量先上升后下降，酶用量低于60 U/m L時(shí)，下降趨勢(shì)明顯，酶用量高于60 U/m L時(shí)，下降幅度很小。根據(jù)模型分析的結(jié)果，發(fā)酵時(shí)間和酶用量的交互作用不顯著。

由圖6可以看出，蛋白酶用量固定為60 U/m L時(shí)，隨著發(fā)酵溫度的升高，多肽產(chǎn)量不斷提高，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，發(fā)酵溫度低于37℃時(shí)，下降趨勢(shì)明顯，發(fā)酵溫度高于37℃時(shí)，下降趨勢(shì)較小。根據(jù)模型分析的結(jié)果，發(fā)酵時(shí)間與發(fā)酵溫度之間的交互作用也為不顯著。

由圖7可以看出，發(fā)酵時(shí)間固定為8 h時(shí)，發(fā)酵溫度低于37℃時(shí)，隨著酶用量的增加，多肽產(chǎn)量不斷提高，而發(fā)酵溫度高于37℃時(shí)，多肽產(chǎn)量基本處于平穩(wěn)狀態(tài)，酶用量增加帶來(lái)的效果并不明顯；隨著發(fā)酵溫度的升高，多肽產(chǎn)量先上升后趨于平穩(wěn)，酶用量低于60 U/m L時(shí)平穩(wěn)階段到來(lái)較晚，酶用量高于60 U/m L時(shí)平穩(wěn)階段到來(lái)較早。根據(jù)模型分析的結(jié)果，發(fā)酵溫度與酶用量的交互作用極顯著。

根據(jù)模型分析的結(jié)果，發(fā)酵時(shí)間、酶用量、發(fā)酵溫度三個(gè)因素的影響作用由大到小排列依次為發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時(shí)間＞酶用量。通過(guò)模型優(yōu)化，得到的最佳產(chǎn)肽工藝參數(shù)為：發(fā)酵時(shí)間8.78 h，蛋白酶用量59.28 U/m L，發(fā)酵溫度39.62℃，此條件下理論多肽產(chǎn)量為7.07 g/L。

2.4.3 工藝參數(shù)驗(yàn)證試驗(yàn)

為了驗(yàn)證響應(yīng)面優(yōu)化法所得結(jié)果的準(zhǔn)確性，采用上述工藝參數(shù)進(jìn)行多肽的制備?？紤]到實(shí)驗(yàn)可操作性，將實(shí)際的工藝調(diào)整為發(fā)酵時(shí)間8.8 h，酶用量59 U/m L，發(fā)酵溫度為39.6℃，最終得到的多肽產(chǎn)量為（7.11±0.07）g/L，與模型估計(jì)值7.07 g/L相比，相對(duì)誤差為0.57%，小于5%，響應(yīng)面法所得的優(yōu)化條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，該模型具有實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以酪蛋白為原料，以瑞士乳桿菌為發(fā)酵菌種，輔助添加蛋白酶，研究確定菌酶協(xié)同發(fā)酵對(duì)酪蛋白源多肽產(chǎn)量的影響。通過(guò)比較不同蛋白酶對(duì)提高多肽產(chǎn)量的促進(jìn)效果，篩選出制備酪蛋白源多肽的最佳蛋白酶為酸性蛋白酶。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，用響應(yīng)面法進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，得到了多肽產(chǎn)量與發(fā)酵時(shí)間、酶用量和發(fā)酵溫度的回歸模型。發(fā)現(xiàn)發(fā)酵時(shí)間、酶用量、發(fā)酵溫度以及酶用量和發(fā)酵溫度的交互作用對(duì)多肽產(chǎn)量的影響均為極顯著（P＜0.01）。確定最佳工藝參數(shù)為：發(fā)酵時(shí)間8.8 h，酶用量59 U/m L，發(fā)酵溫度39.6℃。在此條件下多肽產(chǎn)量為(7.11±0.07)g/L。與原工藝只用瑞士乳桿菌發(fā)酵相比，產(chǎn)量提高73.84%。此結(jié)果為今后酪蛋白源多肽的生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)，有助于酪蛋白源多肽生物活性的研究。