胡永婷，張必雄,，王 佳，馮志新，邵國(guó)青,3，熊祺琰*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷 030801；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇南京210014；3.肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京210095)

豬鼻支原體(Mycoplasma hyorhinis)是一種豬場(chǎng)感染率很高的人獸共患性疾病病原，可引起感染豬的多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、肺炎、中耳炎等[1-3]，并可與多種病原共感染，加重疫情，給養(yǎng)豬業(yè)造成較大經(jīng)濟(jì)損失。近年來(lái)多項(xiàng)研究顯示M.hyorhinis與人類多種癌癥的發(fā)生有明顯相關(guān)性[4-6]，對(duì)人類的健康構(gòu)成潛在威脅。

支原體感染的前提是黏附，因此深入研究M.hyorhinis的黏附因子對(duì)闡釋其致病機(jī)制和研究疫病防控措施均具有重要意義。本團(tuán)隊(duì)在前期研究中證實(shí)可變脂蛋白(Variable lipoprotein，Vlp)家族為其黏附因子之一[7-9]。Vlp家族共有7個(gè)成員，分別為VlpA、VlpB、VlpC、VlpD、VlpE、VlpF和 VlpG，全部成員均具有黏附細(xì)胞能力。7個(gè)成員有著類似的分子結(jié)構(gòu)(圖 1)：Ⅰ區(qū)為信號(hào)肽區(qū)；Ⅱ區(qū)主要由不帶電荷的氨基酸組成，各成員序列間有一定的保守性；Ⅲ區(qū)為一個(gè)“數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)區(qū)”(Variable number of tandem repeats，VNTR)，各成員間序列各不相同，且重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)在不同菌株或不同代次間有很大的差異性[10]。在前期研究基礎(chǔ)上本研究對(duì)M.hyorhinisVlpB的黏附功能展開深入研究，包括對(duì)其不同區(qū)段的黏附能力檢測(cè)，以及Ⅲ區(qū)重復(fù)序列重復(fù)次數(shù)的變化對(duì)其黏附功能的影響。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料豬氣管上皮細(xì)胞(Swine tracheal epithelial cells，STEC)由上海撫生實(shí)業(yè)有限公司提供。VlpB陽(yáng)性血清為江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)所自制；細(xì)胞膜蛋白質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)抽提試劑盒以及BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自碧云天股份有限公司；鼠抗硫氧還蛋白單克隆抗體(MAb)、鼠抗HiS標(biāo)簽單抗，羊抗鼠IgG-HRP、羊抗鼠IgG-FITC均購(gòu)自金斯瑞生物科技有限公司；短肽的合成及偶聯(lián)由Synpeptide有限公司完成。PCR各種試劑、T4 DNA連接酶、DNA和蛋白Marker均購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)STEC(含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的1640培養(yǎng)基)培養(yǎng)至融合率達(dá)到90%以上時(shí)，利用胰蛋白酶消化后稀釋至2×105個(gè)/mL，接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μL，于 5%CO2、37℃培養(yǎng) 24 h。

1.3 VlpB黏附細(xì)胞能力的檢測(cè)利用細(xì)胞培養(yǎng)液將本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的VlpB蛋白[7](Ⅲ區(qū)重復(fù)序列重復(fù)次數(shù)為 6，以下稱為 VlpB6)稀釋至 50 μg/mL，加入接種有 STEC的 96孔板中，100 μL/孔，37℃孵育1 h，設(shè)置相同濃度的pET-32a(+)空載體作為對(duì)照。洗滌后冰乙醇固定30 min，5%BSA 4℃封閉過(guò)夜，以鼠抗硫氧還蛋白MAb(1∶2 000)為一抗，羊抗小鼠IgG-FITC(1∶500)為二抗，進(jìn)行IFA檢測(cè)，同時(shí)利用激光共聚焦顯微鏡觀察分析(其中激光共聚焦顯微鏡觀察時(shí)用DAPI染核)。在黏附抑制試驗(yàn)中，將 50 μg/mL VlpB6 先與 VlpB 陽(yáng)性兔血清(1∶10)混合于37℃孵育1.5 h，其余同上試驗(yàn)。

同時(shí)，參考文獻(xiàn)[9]，利用微孔板黏附試驗(yàn)對(duì)其黏附能力和黏附抑制能力進(jìn)行量化檢測(cè)。

1.4 含vlpBⅡ區(qū)基因的重組質(zhì)粒的構(gòu)建VlpB僅含Ⅱ區(qū)不含Ⅲ區(qū)的重組蛋白(即Ⅲ區(qū)重復(fù)片段重復(fù)次數(shù)為0)以下簡(jiǎn)稱VlpB0，其結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。根據(jù)Gen-Bank中登錄的M.hyorhinis(HUB-1株，CP002170.1)vlpB的基因序列，合成vlpBⅡ區(qū)基因(兩端分別添加HindⅢ和EcoRⅠ位點(diǎn))，同時(shí)進(jìn)行E.coli偏愛(ài)密碼子的優(yōu)化。vlpBⅡ區(qū)基因通過(guò)HindⅢ/EcoRⅠ酶切后克隆至載體pET-32a(+)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32a(+)/vlpB0，轉(zhuǎn)化E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆菌落進(jìn)行PCR篩選，并通過(guò)測(cè)序鑒定所獲得的序列的正確性，命名為vlpB0。

圖1 vlpB結(jié)構(gòu)和本研究中使用的蛋白結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Structure of vlpB and the proteins used in the present study

1.5 VlpBⅢ區(qū)重復(fù)片段的合成與偶聯(lián)化學(xué)合成VlpB蛋白III區(qū)重復(fù)片段短肽，重復(fù)2次，在其N端添加一個(gè)用于偶聯(lián)KLH的半胱氨酸，命名為PepVlpB(NH2-CGTGSDSQDSGAKGTGSDSQDSGAKCOOH)。經(jīng)高效液相色譜純化后，短肽的純度大于85%。將短肽與KLH按1∶1質(zhì)量比偶聯(lián)，獲得偶聯(lián)蛋白KLH-PepVlpB。

1.6 含VlpBⅢ區(qū)重復(fù)片段重復(fù)次數(shù)不等的系列重組質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)GenBank中登錄的vlpB的基因序列，設(shè)計(jì)Ⅲ區(qū)重復(fù)次數(shù)分別為3、6(前期研究已構(gòu)建)、9、12次的重組蛋白基因序列，插入pET-32a(+)載體中構(gòu)建pET-vlpBn，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)得到相應(yīng)重組蛋白，命名為VlpBn(n代表3、6、9、12次重復(fù))，其結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1，構(gòu)建方法同VlpB0。

1.7 重組蛋白的表達(dá)、純化及鑒定取重組工程菌37℃培養(yǎng)至 OD630nm值達(dá)到 0.6～0.8時(shí)加入終濃度為1 mol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，5 h后收集菌液。超聲破碎后于4℃ 9 000 r/min離心20 min，收集上清液，利用鎳柱進(jìn)行純化。利用抗His標(biāo)簽鼠MAb(1∶8 000)為一抗，羊抗鼠 IgG-HRP(1∶5 000)為二抗，western blot鑒定重組蛋白VlpBn的表達(dá)。

1.8 微孔板黏附試驗(yàn)定量檢測(cè)各VlpB黏附細(xì)胞能力參照文獻(xiàn)[9]，利用微孔板黏附試驗(yàn)檢測(cè)VlpBn的黏附細(xì)胞能力，并分析其粘附功能區(qū)域及III區(qū)重復(fù)次數(shù)對(duì)VlpB粘附能力的影響。將重組蛋白VlpBn或多肽偶聯(lián)物KLH-PepVlpB用1%BSA稀釋至特定濃度(在不同vlpBn比較時(shí)選擇等摩爾比以避免等質(zhì)量比各蛋白摩爾濃度不等帶來(lái)的黏附差異影響)，并設(shè)置相同濃度梯度的空載體蛋白或KLH蛋白作為對(duì)照，每孔加入各待檢樣品的100 μL，在 37℃黏附1.5 h后洗滌。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析利用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)得到的各組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，當(dāng)p＜0.05時(shí)表示差異顯著，當(dāng)p＜0.01時(shí)表示差異極顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 vlpB黏附細(xì)胞能力檢測(cè)利用本實(shí)驗(yàn)室前期已構(gòu)建的VlpB6驗(yàn)證VlpB的黏附細(xì)胞能力。結(jié)果顯示，VlpB可黏附STEC，加入VlpB陽(yáng)性兔血清預(yù)先孵育后，其黏附力顯著下降。由激光共聚焦顯微鏡觀察可見(jiàn)，VlpB可以結(jié)合在整個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞膜上，加入VlpB陽(yáng)性兔血清預(yù)先孵育后，其黏附力被顯著抑制(圖2)。

圖2 顯微鏡觀察VlpB黏附STECFig.2 Observation of the adhesion of VlpB to STEC by microscope

微孔板黏附試驗(yàn)結(jié)果顯示VlpB可黏附STEC，并呈現(xiàn)劑量依賴性(圖3A)。加入其陽(yáng)性血清預(yù)孵育后，黏附力顯著降低(p＜0.01)，而陰性血清抑制不明顯，表明VlpB對(duì)STEC具有特異性的黏附能力(圖 3B)。

2.2 vlpBⅡ區(qū)重組質(zhì)粒和Ⅲ區(qū)重復(fù)片段重復(fù)次數(shù)不等的系列vlpB重組質(zhì)粒的構(gòu)建、表達(dá)、純化與鑒定構(gòu)建Ⅲ區(qū)重復(fù)次數(shù)不等的一系列vlpB重組質(zhì)粒pET-vlpn，其重復(fù)次數(shù)n分別為0(即僅含Ⅱ區(qū)重組蛋白)、3、6、9、12次。對(duì)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌落分別提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示各PCR產(chǎn)物大小與目的片段一致(圖4)，測(cè)序結(jié)果正確，分別命名為VlpBn(n代表不同重復(fù)次數(shù))。

IPTG誘導(dǎo)重組蛋白VlpBn表達(dá)，并利用鎳柱親和層析純化，SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果顯示所有重組蛋白均能有效表達(dá)，純度均在80%以上(圖5)。上述蛋白經(jīng)透析濃縮后，進(jìn)行western blot鑒定顯示，獲得的各重組蛋白條帶大小均與預(yù)期相符(圖6)，表明構(gòu)建表達(dá)了VlpB各目的蛋白。

圖3 微孔板黏附試驗(yàn)檢測(cè)VlpB黏附STECFig.3 Detection of the adhesion of VlpB to STEC cells by the microplate adhesion test

圖4 重組表達(dá)質(zhì)粒pET-vlpBn的PCR鑒定Fig.4 Identification of the recombinant expression plasmids of pET-vlpBn by PCR

圖5 重組蛋白VlpBn表達(dá)純化的SDS-PAGE檢測(cè)Fig.5 Detection of the expressed and purified recombinant VlpBn proteins by SDS-PAGE

2.3 VlpB黏附細(xì)胞功能區(qū)域初步鑒定利用僅含Ⅱ區(qū)的重組蛋白VlpB0和Ⅲ區(qū)重復(fù)片段鑒定VlpB分子黏附細(xì)胞的功能區(qū)域。微孔板黏附試驗(yàn)結(jié)果顯示，Ⅲ區(qū)重復(fù)片段多肽的偶聯(lián)蛋白KLH-PepVlpB可以黏附STEC(圖7)，表明VlpB的Ⅲ區(qū)含有黏附表位，但呈一定劑量依賴性，當(dāng)濃度超過(guò)100 μg/mL時(shí)，KLH-PepVlpB黏附能力不再明顯升高。僅含Ⅱ區(qū)的重組蛋白VlpB0也可黏附STEC(圖8)，且呈現(xiàn)明顯劑量依賴性，表明VlpB的Ⅱ區(qū)也含有黏附表位。

圖6 重組蛋白VlpBn的western blot鑒定Fig.6 Identification of the recombinant VlpBn proteins by western blot

圖7 微孔板黏附試驗(yàn)檢測(cè)KLH-PepVlpB偶聯(lián)蛋白對(duì)STEC的黏附Fig.7 Identification of the cytoadhesion of KLH-PepVlpB by the microplate adhesion test

2.4 Ⅲ區(qū)重復(fù)次數(shù)對(duì)VlpB黏附細(xì)胞能力的影響對(duì)所構(gòu)建的Ⅲ區(qū)重復(fù)次數(shù)不等的5種VlpBn重組蛋白進(jìn)行黏附能力比較，利用SPSS23.0軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果顯示，與空載體蛋白相比VlpB0、3、6、9、12均可黏附 STEC，且均呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。與VlpB0相比，VlpB 3、6、9、12蛋白的黏附能力均明顯降低，且總體而言Ⅲ區(qū)重復(fù)次數(shù)越多，黏附能力越小(圖8)。推測(cè)可能III區(qū)重復(fù)會(huì)影響到其黏附位點(diǎn)的暴露，從而導(dǎo)致其黏附能力隨III區(qū)重復(fù)次數(shù)增多而降低。

圖8 微孔板黏附試驗(yàn)檢測(cè)重組蛋白VlpBn的黏附細(xì)胞能力Fig.8 The cytoadhesion detection of the recombinant VlpBn proteins by microplate adhesion test

3 討論

目前研究認(rèn)為支原體一般不含有典型的毒力因子，而是通過(guò)長(zhǎng)期的持續(xù)性感染引發(fā)宿主機(jī)體慢性炎癥應(yīng)答而導(dǎo)致病變的發(fā)生。黏附細(xì)胞是支原體感染的第一步，因此黏附因子在支原體感染致病的過(guò)程中起著非常重要的作用。但M.hyorhinis黏附因子的研究尚處于起步階段，Kornspan首先指出介導(dǎo)M.hyorhinis黏附細(xì)胞的相關(guān)因子應(yīng)該是位于細(xì)胞膜上的脂蛋白[11]。本團(tuán)隊(duì)在前期研究中證明可變脂蛋白Vlp家族為其黏附因子之一[7-9]，為首個(gè)報(bào)道的M.hyorhinis黏附因子。

支原體可變蛋白家族在許多致病性的支原體中普遍存在，其基因編碼大容量的可變抗原庫(kù)使得菌體表面的抗原性發(fā)生變化，是支原體有效逃避宿主的免疫系統(tǒng)、實(shí)現(xiàn)在宿主體內(nèi)持續(xù)感染和增殖的重要工具。除介導(dǎo)免疫逃逸外，可變蛋白還同時(shí)具有其它生物功能。在多種支原體中顯示可變蛋白具有黏附細(xì)胞能力，包括雞毒支原體表面可變蛋白pMGA[12]、牛支原體的表面可變脂蛋白Vsps[13]、人型支原體的表面可變脂蛋白vaa[14]。

M.hyorhinis可變脂蛋白Vlp家族共有7個(gè)成員，前期研究證明其均具有黏附細(xì)胞能力[8]。本研究主要對(duì)VlpB的黏附特性進(jìn)行深入研究。首先將成熟VlpB分為Ⅱ區(qū)和Ⅲ區(qū)分別研究其是否含有黏附位點(diǎn)，結(jié)果顯示僅含Ⅱ區(qū)的重組蛋白VlpB0和由Ⅲ區(qū)重復(fù)肽段偶聯(lián)KLH的偶聯(lián)蛋白KLH-PepVlpB均可黏附STEC，表明VlpB的Ⅱ區(qū)和Ⅲ區(qū)均含有黏附位點(diǎn)。這與VlpA的情況不同，前期張必雄發(fā)現(xiàn)vlpA的Ⅲ區(qū)重復(fù)肽段不含黏附位點(diǎn)，僅Ⅱ區(qū)具有黏附功能[9]，可能不同的Vlp成員之間含黏附位點(diǎn)的情況存在差異。

Vlp蛋白的Ⅲ區(qū)為重復(fù)片段區(qū)，由長(zhǎng)度為12或13個(gè)氨基酸的肽段串聯(lián)重復(fù)組成，通過(guò)基因片段的插入和缺失，其重復(fù)次數(shù)可以發(fā)生高頻率變異，在不同的菌株或不同的代次之間重復(fù)次數(shù)各不相同，導(dǎo)致Vlp產(chǎn)物的大小發(fā)生高頻變化，這一變化也被認(rèn)為是免疫逃逸的一種機(jī)制[10]。具有數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)序列特征的蛋白，其重復(fù)區(qū)重復(fù)次數(shù)往往會(huì)影響蛋白功能。Costa在研究中發(fā)現(xiàn)重復(fù)區(qū)重復(fù)次數(shù)多的胃上皮細(xì)胞受體蛋白分子能更好地與幽門螺桿菌結(jié)合[15]；Macintosh等構(gòu)建了含不同長(zhǎng)度B重復(fù)片段區(qū)的表皮葡萄球菌表面蛋白(Aap)的基因，觀察其對(duì)角質(zhì)層細(xì)胞的黏附能力，結(jié)果顯示，隨著表皮葡萄球菌表面蛋白B區(qū)重復(fù)次數(shù)的增加其黏附細(xì)胞能力呈現(xiàn)增強(qiáng)的趨勢(shì)[16]；M.hyorhinis重要的黏附因子P97蛋白的重復(fù)片段R1區(qū)的重復(fù)次數(shù)也與其黏附能力有關(guān)[17]。因此，在本研究研究了Ⅲ區(qū)重復(fù)次數(shù)變化對(duì)VlpB分子黏附功能的影響，結(jié)果顯示，僅含Ⅱ區(qū)的VlpB0黏附能力最強(qiáng)，在等摩爾反應(yīng)體系中與VlpB0相比，VlpBn整體分子的黏附能力隨著Ⅲ區(qū)重復(fù)次數(shù)的增加而降低，提示Ⅲ區(qū)的黏附能力可能相對(duì)較弱，當(dāng)重復(fù)次數(shù)增加時(shí)Ⅲ區(qū)增大，可能從空間上影響了Ⅱ區(qū)強(qiáng)黏附位點(diǎn)的暴露性從而導(dǎo)致整體分子黏附力下降。KLH-PepVlpB濃度達(dá)到飽和后黏附水平明顯低于VlpB0也可從側(cè)面支持這一推測(cè)。Citti曾經(jīng)報(bào)道M.hyorhinis抵抗抗體生長(zhǎng)抑制的能力與所表達(dá)Vlp的Ⅲ區(qū)重復(fù)次數(shù)有關(guān)，作者推測(cè)其可能的原因是重復(fù)次數(shù)增加使得Ⅲ區(qū)增大，影響了支原體膜上敏感位點(diǎn)的表面可及性[18]，該研究結(jié)論與本研究結(jié)果有一定的共同性。Vlp脂蛋白前體通過(guò)信號(hào)肽酶切割后得到N端為半胱氨酸的成熟蛋白，通過(guò)半胱氨酸殘基連接脂質(zhì)基團(tuán)形成脂蛋白，再通過(guò)脂質(zhì)基團(tuán)錨定到細(xì)胞膜上，因此從分子特征上分析，VlpB的Ⅱ區(qū)應(yīng)該位于相對(duì)近膜的表面，而Ⅲ區(qū)則可能位于外側(cè)，Ⅲ區(qū)大小的變化可能對(duì)內(nèi)側(cè)蛋白或區(qū)段形成遮擋，這進(jìn)一步提示Vlp的長(zhǎng)度變異可能通過(guò)影響支原體表面不同位點(diǎn)的暴露性而影響其包括黏附在內(nèi)的多方面生物學(xué)特性。但該推測(cè)需要更多的實(shí)驗(yàn)來(lái)證明。

本研究證實(shí)了M.hyorhinis表面的可變脂蛋白家族成員之一VlpB參與介導(dǎo)M.hyorhinis黏附宿主細(xì)胞，其Ⅱ區(qū)和Ⅲ區(qū)均含有黏附表位，并發(fā)現(xiàn)整體分子的黏附能力隨著Ⅲ區(qū)重復(fù)次數(shù)增加而降低，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果將有助于對(duì)M.hyorhinis的黏附及其致病機(jī)制的進(jìn)一步研究。