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阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一種隱匿起病、呈進行性加重的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床上顯著特征是學習記憶能力衰退[1]。有研究表明，記憶的形成與神經(jīng)元突觸可塑性密不可分，學習記憶能力的衰退與神經(jīng)突觸可塑性降低相關[2]，因而可通過神經(jīng)元突觸可塑性評價學習記憶能力。長時程增強(long-term potentiation，LTP)是神經(jīng)元突觸可塑性的直接表現(xiàn)形式[3-4]，因而通過觀察突觸LTP，可從神經(jīng)電生理水平研究記憶形成及衰退過程[5]。前期研究表明，腹腔注射D-半乳糖聯(lián)合鵝膏蕈氨酸(IBO)定向損毀雙側Meynert核可致大鼠學習記憶能力受損，在致衰基礎上，破壞基底前腦-海馬膽堿能神經(jīng)元投射通路，抑制大鼠海馬LTP，進而影響學習記憶功能。

不忘散是我國中醫(yī)益智古方，出自唐代孫思邈《備急千金藥方》，由遠志、人參、茯苓、茯神、菖蒲5味中藥組成。在古方不忘散基礎上，結合多年臨床經(jīng)驗，增加熟地黃、黃連、白術、當歸4味中藥，形成“加味不忘散”中藥復方，在臨床上用于防治AD取得較好的療效。本研究觀察加味不忘散對AD模型大鼠學習記憶及在體海馬LTP的影響，以此探討加味不忘散對AD的治療作用及其神經(jīng)電生理機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 清潔型雄性Wistar大鼠40只，體重200 g±20 g，由北京市海淀興旺動物養(yǎng)殖公司提供。

1.1.2 主要試劑及儀器 IBO購買于Sigma公司，生理鹽水稀釋，濃度為2 μg/μL；D-半乳糖購于武漢博士德生物有限公司。加味不忘散免煎劑(北京同仁堂)，組方：遠志20 g，人參15 g，熟地黃15 g，茯苓10 g，茯神10 g，白術10 g，當歸10 g，石菖蒲5 g，黃連5 g，免煎劑為顆粒狀每劑含22 g。加味不忘散用生理鹽水溶解，低劑量組濃度為0.9 g/mL，高劑量組濃度為1.8 g/mL。Morris水迷宮圖像采集分析系統(tǒng)購自荷蘭諾達思科技信息公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型的制備及給藥 將大鼠隨機分成空白對照組、AD模型組、加味不忘散低劑量組、加味不忘散高劑量組，每組10只，最終造模成功進入實驗各組大鼠分別為9只、8只、7只、7只。AD模型組、加味不忘散低劑量組、高劑量組均按0.5 mL/100 g腹腔注射D-半乳糖溶液，空白對照組注射等量的生理鹽水，每日1次，持續(xù)6周。第43日，AD模型組、加味不忘散低劑量組、高劑量組在水合氯醛麻醉下，給予雙側Meynert核損毀術：顱頂正中切口暴露顱骨，腦立體定位儀準確定位(前囟后1.4 mm，旁開2.3 mm，深7.0 mm)，使用微量注射器雙側定向注射IBO 1 μL，空白對照組注射等量生理鹽水。從實驗第1日起，加味不忘散低劑量組、高劑量組分別以0.9 g/mL和1.8 g/mL濃度加味不忘散灌胃，空白對照組和模型組以生理鹽水灌胃，劑量為1 mL/100 g，每日1次，持續(xù)8周。

1.2.2 Morris水迷宮實驗 治療結束后，進行Morris水迷宮實驗。水迷宮為直徑150 cm的圓形水池，4個入水點位于均分的四個象限貼壁正中位置。第一象限正中離池壁30 cm處放置直徑15 cm的圓形平臺，平臺低于水面2 cm，水溫22 ℃±1 ℃，實驗室保持安靜，水池四周亮度均等。定位航行試驗：實驗持續(xù)5 d，每日分別從4個象限將大鼠面向池壁放入水中，記錄大鼠找到平臺的時間(逃避潛伏期)。若大鼠在120 s內發(fā)現(xiàn)平臺，記錄時間并使其停留10 s；若120 s內未能發(fā)現(xiàn)平臺，停止實驗并將其放到平臺停留10 s，記錄其逃避潛伏期為120 s?？臻g探索試驗：實驗第6天，移除平臺，使大鼠憑記憶尋找平臺。每次大鼠在水迷宮中停留120 s，共2次，記錄大鼠在120 s內的跨臺次數(shù)。數(shù)據(jù)采集及處理由Morris水迷宮圖像采集分析系統(tǒng)完成。

1.2.3 神經(jīng)電生理實驗 水迷宮實驗結束后，25%烏拉坦腹腔注射麻醉大鼠，并固定于腦立體定位儀上，顱頂正中切口暴露顱骨，以前囟為0點，刺激電極坐標前囟后4.2 mm、旁開3.8 mm，記錄電極坐標前囟后3.4 mm、旁開2.5 mm，顱骨鉆打孔，將同心圓刺激電極及記錄電極綁定并插入大鼠海馬Schaffer側支和CA1區(qū)放射層。首先進行測試，測試電流波寬為0.2 ms，以電流強度為橫軸，以興奮性突觸后電位(excitatory postsynaptic potential，EPSP)為縱軸，描繪輸入輸出曲線，以引起最大幅度EPSP50%的刺激電流為基礎刺激電流，在刺激電流不變前提下，不斷調整綁定電極深度(即調整腦立體定位儀Z軸)，觀察EPSP幅度0.4 mV～0.6 mV，固定電極Z軸位置并記錄EPSP波形30 min以上，以此數(shù)據(jù)為基礎EPSP。誘發(fā)LTP的高頻刺激(high frequency stimulation，HFS)頻率為200 Hz，電流強度同測試刺激，波寬為0.2 ms，共3串刺激脈沖，每串200個，串間隔為30 s。給予HFS后，引起LTP，連續(xù)記錄1 h，利用多導生理信號采集系統(tǒng)記錄并分析。

2 結 果

2.1 Morris水迷宮實驗結果 前5天定位航行實驗，各組大鼠逃避潛伏期均逐漸縮短，表明大鼠有一定的空間學習記憶能力。AD模型組較空白對照組逃避潛伏期顯著延長(P<0.001)，且在第6天跨臺次數(shù)顯著減少(P<0.001)，說明AD模型組空間學習記憶能力明顯受損，提示AD造模成功。加味不忘散低劑量組、高劑量組較AD模型組逃避潛伏期縮短(P<0.001)，跨臺次數(shù)增加(P<0.01或P<0.001)，說明加味不忘散對AD模型大鼠空間學習記憶能力有顯著改善。加味不忘散高劑量組較低劑量組逃避潛伏期縮短(P<0.001)，跨臺次數(shù)增加(P<0.001)，說明加味不忘散對AD模型大鼠學習記憶能力的改善作用具有劑量依賴性。詳見表1。

表1 4組大鼠逃避潛伏期變化及跨臺次數(shù)比較(±s)

2.2 神經(jīng)電生理實驗結果 觀察指標為HFS后fEPSP與刺激前fEPSP的百分比，即fEPSP的增幅。HFS后1 min，4組大鼠fEPSP增幅均超過150%，表明LTP誘導成功。4組fEPSP增幅隨著時間增加而衰減，空白對照組HFS后1 min、fEPSP增幅，較AD模型組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，說明AD模型組大鼠LTP受到顯著抑制。加味不忘散低劑量組、加味不忘散高劑量組HFS后1 min、30 min、60 min fEPSP增幅較AD模型組顯著增加(P<0.001)，加味不忘散高劑量組較加味不忘散低劑量組HFS后1 min、30 min、60 min fEPSP增幅顯著增加(P<0.01)，說明加味不忘散對學習記憶的改善作用具有劑量依賴性。詳見表2。

表2 HFS刺激后fEPSP增幅(±s) %

3 討 論

AD是臨床上常見導致癡呆的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，該病發(fā)病機制復雜[6]。在動物實驗中，建立一種可全面模擬發(fā)病機制的AD模型是實驗成功的前提條件。有研究表明，在神經(jīng)電生理水平，長期注射D-半乳糖可破壞海馬突觸超微結構，進而導致大鼠海馬LTP誘導率和誘導波幅均顯著下降[7]。大鼠基底前腦發(fā)出的纖維廣泛投射到海馬及大腦皮層，這一通路與學習、記憶能力密切相關。膽堿能神經(jīng)元突觸傳遞是膽堿能神經(jīng)元和腦內其他神經(jīng)元之間的重要交流方式，AD病人腦內乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)含量明顯下降，基底前腦膽堿能神經(jīng)元(basal forebrain cholinergic neurons，BFCNs)大量丟失，引起其膽堿能神經(jīng)元突觸傳遞嚴重受損[8]。有研究表明，在基底前腦注射IBO，破壞基底前腦-海馬膽堿能神經(jīng)元投射通路，進而影響學習記憶功能，這一方法廣泛應用于AD造模[9-10]。有學者提出，聯(lián)合上述兩種方法建立AD模型思路，該模型簡單、經(jīng)濟，且能全面模擬AD發(fā)病特征，已被廣泛利用[11]。本研究結果顯示，相較于空白對照組，D-半乳糖腹腔注射聯(lián)合IBO損毀Meynert核的AD模型大鼠，學習記憶能力顯著下降，LTP顯著抑制，進一步證實該模型的有效性和可行性。

大量證據(jù)表明，AD病人早期出現(xiàn)海馬突觸功能改變，LTP作為突觸可塑性的重要表現(xiàn)形式，可直觀了解突觸功能的改變[3，5]。本課題組前期研究表明，學習記憶能力受損的大鼠LTP受到顯著抑制，遠志等中藥可顯著減輕這種抑制作用[12-13]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，AD模型組大鼠學習記憶能力顯著下降，LTP受到明顯壓抑。通過加味不忘散治療后，可提高AD大鼠的學習記憶能力，可能與改善LTP的抑制，進而提高海馬突觸可塑性有關。

本研究結果顯示，加味不忘散組較AD模型組大鼠學習記憶能力顯著增強，同時大鼠海馬LTP抑制顯著減輕，表明加味不忘散顯著提高大鼠海馬的突觸功能，改善大鼠學習記憶能力，且該作用有劑量依賴性。本研究結果為加味不忘散在臨床的應用提供理論基礎，促進中醫(yī)中藥防治AD。