，，，，

目前老齡化是嚴(yán)重的社會問題之一，也是引起心腦血管疾病極其重要的危險(xiǎn)因素。血管內(nèi)皮細(xì)胞是處于血液與血管平滑肌之間的半通透性屏障，同時(shí)也是一個(gè)活躍的內(nèi)分泌器官，在維持血管的完整性、調(diào)節(jié)血管穩(wěn)態(tài)等方面起重要作用。內(nèi)皮細(xì)胞衰老是血管整體老化的重要病理改變之一，引起血管功能紊亂，繼而促進(jìn)多種心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展，如動脈粥樣硬化、心肌梗死、高血壓、腦卒中等[1]。血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老在動脈粥樣硬化發(fā)病中起著重要作用，MicroRNA-217(miRNA-217)參與調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞衰老的進(jìn)程[2-3]。前期研究證實(shí)，與模型組比較，阿托伐他汀鈣組和補(bǔ)腎活血方組主動脈粥樣硬化程度減輕，血管內(nèi)皮端粒酶活性表達(dá)明顯降低(P<0.01)[4]。本實(shí)驗(yàn)采用兔動脈粥樣硬化模型，觀察補(bǔ)腎活血方對miRNA-217相關(guān)信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 2月齡雄性新西蘭大耳兔44只，體重2.0 kg～3.0 kg，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物中心[許可證號：SCXK(滬)2012-0002]。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 補(bǔ)腎活血方(組方：熟地黃10 g，枸杞子10 g，制黃精10 g，丹參10 g，川芎6 g，三七粉3 g，瓜蔞20 g，生山楂10 g)，由上海市中醫(yī)醫(yī)院制劑室制備。阿托伐他汀鈣(美國輝瑞制藥有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號：D1420203390，規(guī)格：每片20 mg)。

1.3 分組、造模及處理 將44只新西蘭大耳兔隨機(jī)分為對照組、模型組、補(bǔ)腎活血方組和阿托伐他汀鈣組，各11只，其中對照組給予普通飼料，模型組、補(bǔ)腎活血方組和阿托伐他汀鈣組給予高脂飼料(5%豬油、1%膽固醇、94%基礎(chǔ)飼料)。造模8周后，各組隨機(jī)處死1只，肉眼觀察模型組、補(bǔ)腎活血方組、阿托代他汀鈣組主動脈內(nèi)膜，發(fā)現(xiàn)均有動脈粥樣硬化斑塊形成，確認(rèn)造模成功，其他各組10只繼續(xù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對照組繼續(xù)給予普通飼料喂養(yǎng)，模型組、補(bǔ)腎活血方組、阿托代他汀鈣組給予高脂飼料喂養(yǎng)；對照組、模型組每日給予等量生理鹽水(10 mL/kg)灌胃1次，補(bǔ)腎活血方組、阿托伐他汀鈣組給予相應(yīng)藥物(10 mL/kg)灌胃1次，共灌胃8周。

1.4 實(shí)驗(yàn)試劑 Trizol：Invitrogen life technologies；上下游引物合成：上海皓嘉科技發(fā)展有限公司；DNA marker、SYBR(R) Prime Script RT-PCR Kit：TaKaRa；瓊脂糖：上海生工生物工程有限公司。苯甲基磺酰氟(PMSF)：Amresco；細(xì)胞裂解液，十二烷基硫酸-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠試劑盒、SDS-PAGE電泳液、轉(zhuǎn)膜液、封閉液、洗滌液、一抗稀釋液、二抗稀釋液：碧云天；辣根過氧化物酶HRP-ECL發(fā)光檢測試劑盒：PIRECE；一抗：cell signaling technology；二抗：santa。

1.5 標(biāo)本取材 麻醉后腹主動脈取血8 mL，開胸，取胸主動脈，剝離血管外結(jié)締組織，4 ℃生理鹽水中沖洗3次，部分加入10%甲醛溶液固定，部分放入-80 ℃冰箱保存待用。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測miRNA-217基因表達(dá)水平 Trizol法提取總RNA，紫外吸收法測定A260/A280比值，變性瓊脂糖凝膠電泳法證實(shí)所提取RNA的完整性。反轉(zhuǎn)錄后，先繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，之后將所有樣品分別進(jìn)行目的基因和管家基因的實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)，最后采用相對定量——△△Ct法計(jì)算：

F=2-[待測組目的基因平均Ct值-待測組看家基因平均Ct值]-[對照組目的基因平均Ct值-對照組看家基因平均Ct值]

引物序列如下：內(nèi)參β-actin：上游：5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3′，下游：5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′；miRNA-217：5′-TACTGCATCAGGAACTGACTGGA-3′，反應(yīng)條件：β-actin：95 ℃ 15 s，30個(gè)循環(huán)(95 ℃ 5 s，62 ℃ 20 s)擴(kuò)增，62 ℃～95 ℃繪制溶解度曲線；miRNA-217：95 ℃ 15 s，30個(gè)循環(huán)(95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 25 s)擴(kuò)增，62 ℃～95 ℃繪制溶解度曲線。

1.6.2 免疫印跡實(shí)驗(yàn)(western blot) 檢測沉默信號調(diào)節(jié)器1(silent information regulator 1，Sirt1)/叉頭轉(zhuǎn)錄因子(FoxO1)蛋白表達(dá)，取少量心肌組織在液氮中研磨，之后放入裂解液，粗提蛋白，BCA法測定蛋白量。之后取40 μg蛋白入10% SDS-PAGE凝膠電泳中，分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，封閉后加入Sirt1、FoxO1一抗及二抗稀釋液孵育，顯色，應(yīng)用圖像數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)拍照，測定各條帶的吸光度值，最后分析各組蛋白相對含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間比較采用ANOVA(one or two way)或t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)驗(yàn)完成情況 因本實(shí)驗(yàn)相對比較成熟，實(shí)驗(yàn)過程中無兔子自然死亡。

2.2 4組miRNA-217基因表達(dá)水平比較 與對照組比較，模型組miRNA-217表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；阿托伐他汀鈣組和補(bǔ)腎活血方組與模型組比較，miRNA-217表達(dá)降低(P<0.01)；補(bǔ)腎活血組與阿托伐他汀鈣組比較，miRNA-217表達(dá)降低(P<0.05)。詳見表1。

表1 4組miRNA-217基因表達(dá)水平比較(±s)

2.3 4組Sirt1、FoxO1蛋白表達(dá)水平比較 模型組Sirt1、FoxO1蛋白水平明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；阿托伐他汀鈣組和補(bǔ)腎活血方組Sirt1、FoxO1蛋白水平高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與阿托伐他汀鈣組比較，補(bǔ)腎活血組Sirt1蛋白水平高于阿托伐他汀鈣組(P<0.05)。詳見表2。

表2 4組Sirt1、FoxO1蛋白表達(dá)水平比較(±s)

3 討 論

MicroRNA(miRNA)是一類由內(nèi)源基因編碼，長度約22個(gè)核苷酸序列的非編碼單鏈RNA 分子，參與轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控，并廣泛參與生物生長、發(fā)育、衰老、死亡等過程。其中miRNA-217在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、主動脈內(nèi)皮細(xì)胞、冠狀動脈等均有表達(dá)，可參與調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞衰老的進(jìn)程[5-6]。通過抑制Sirt1的表達(dá)，使下游FoxO1和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)乙?；黄渲幸阴；疐oxO1可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，乙?；痚NOS活性降低，一氧化氮生成減少，氧自由基積聚，從而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞老化[7-8]。

國外研究發(fā)現(xiàn)，Sirt蛋白家族在代謝性疾病及衰老相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[9]。目前，Sirt家族基因研究較多的是Sirt1。Sirt1是哺乳動物Sirtuin家族的一員，是酵母Sirt2最相近的同源物，是一種煙酰胺腺嘌呤二核酸依賴性的組蛋白去乙酰化酶，參與多種生物學(xué)過程，可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、DNA損傷修復(fù)、衰老和代謝[9]，并參與多種生物體在能量限制應(yīng)答中的壽命延長[9-11]。Sirt1通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和改善血管內(nèi)皮舒張功能及抑制平滑肌肥大增生影響動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展[12-13]。內(nèi)皮Sirt1是體內(nèi)一種真正的抗動脈粥樣硬化因子。轉(zhuǎn)染腺病毒Sirt1的內(nèi)皮細(xì)胞能抵抗氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。內(nèi)皮特異過表達(dá)Sirt1促進(jìn)高膽固醇狀況的血管內(nèi)皮依賴性血管舒張功能，高脂飲食及動脈粥樣硬化危險(xiǎn)因素降低主動脈Sirt1表達(dá)水平[14-15]。

中醫(yī)學(xué)雖無“動脈粥樣硬化”的病名，但可歸于“胸痹”“心痛”“真心痛”“眩暈”“中風(fēng)”等范疇。腎為生命之根，先天之本。此類病人多為中老年人，腎氣漸虧，腎虛氣化無力，不能推動血行，瘀血即成，不能推動水濕運(yùn)行，痰濁即成。動脈粥樣硬化病機(jī)以腎精虛衰為本，痰瘀內(nèi)阻為標(biāo)，治療上自擬補(bǔ)腎活血方，方中熟地黃、枸杞子、制黃精滋腎陰；川芎、丹參、三七粉活血通絡(luò)，使上藥補(bǔ)而不滯；瓜蔞祛痰，生山楂活血化瘀，固護(hù)脾胃，以防養(yǎng)陰藥滋膩滯氣，全方共奏補(bǔ)腎活血祛痰之功。

本研究通過高脂喂養(yǎng)新西蘭兔形成動脈粥樣硬化模型，前期研究發(fā)現(xiàn)：隨著動脈粥樣硬化進(jìn)程，內(nèi)皮細(xì)胞提前衰老[4]。本研究結(jié)果顯示：隨著內(nèi)皮細(xì)胞提前衰老，miRNA-217基因表達(dá)升高，同時(shí)其下游Sirt1、FoxO1蛋白表達(dá)降低。補(bǔ)腎活血方和阿托伐他汀鈣皆可通過下調(diào)miRNA-217，上調(diào)Sirt1、FoxO1表達(dá)，延緩內(nèi)皮細(xì)胞衰老，從而延緩動脈粥樣硬化的發(fā)生。提示補(bǔ)腎活血方和阿托伐他汀鈣抗動脈粥樣硬化可能通過調(diào)控miRNA-217/Sirt1/FoxO1信號通路延緩內(nèi)皮細(xì)胞衰老從而起到抗動脈粥樣硬化作用。