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腦梗死已成為目前嚴(yán)重危害人類健康的世界問題，動脈粥樣硬化是缺血性卒中的主要病理過程，而炎癥因子是促進(jìn)動脈粥樣硬化的重要因素，檢測炎性因子可了解缺血性腦卒中發(fā)生的危險因素，進(jìn)行針對性預(yù)防及治療腦梗死，減少病人家庭及社會負(fù)擔(dān)。

缺血性腦卒中是一種復(fù)雜的多因素疾病，其發(fā)病率隨著高血壓、吸煙和糖尿病等危險因素增加而增加。缺血性腦卒中主要由不同程度管腔狹窄及不穩(wěn)定斑塊脫落形成栓子導(dǎo)致。動脈粥樣硬化是缺血性卒中的主要病理過程，炎癥因子是促進(jìn)動脈粥樣硬化的重要因素，檢測炎性因子可了解缺血性腦卒中發(fā)生的危險因素，針對性地預(yù)防及治療腦梗死，減少病人家庭及社會的負(fù)擔(dān)。動脈粥樣硬化是長期慢性炎癥性疾病，導(dǎo)致腦血管疾病的發(fā)病[1-2]。5-脂氧合酶激活蛋白(ALOXPAP)和5-脂氧合酶(5-LO)通路產(chǎn)物白三烯在動脈粥樣硬化過程中可起到促進(jìn)作用，其異常表達(dá)最終可導(dǎo)致腦血管疾病發(fā)生[3]。ALOXPAP基因的相關(guān)突變可能引起白三烯等物質(zhì)分泌，因動脈血管閉塞形成缺血性腦卒中[4]。本研究觀察ALOX5AP基因rs4293222位點多態(tài)性與動脈粥樣硬化性腦梗死的相關(guān)研究，初步探討新疆維吾爾族及漢族腦梗死的ALOX5AP基因rs4293222位點多態(tài)性的差異性，從而了解民族間腦梗死的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2017年6月—2017年12月在新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院腦病治療的維吾爾族和漢族腦梗死病人100例，其中漢族50例，維吾爾族50例。所有病人均完善頭顱CT或MRI掃描，并經(jīng)過腦病科至少兩位主治以上醫(yī)師臨床診斷，評估明確診斷。納入標(biāo)準(zhǔn)：診斷需符合第四屆中國腦卒中學(xué)術(shù)大會缺血性腦卒中診斷要求；完善頭顱CT平掃或MRI平掃檢查；病人或授權(quán)委托人知情同意，并簽署相關(guān)知情文件。排除標(biāo)準(zhǔn)：短暫性腦缺血發(fā)作、腔隙性腦梗死及溶栓病人；蛛網(wǎng)膜下腔出血、顱內(nèi)占位等；血液病、動脈炎等所致的腦卒中；嚴(yán)重臟器疾病，如心臟疾病、酗酒、嚴(yán)重感染、嚴(yán)重腎功能不全、接受器官移植、阿爾茨海默病、免疫系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤等；因身體植入鋼板、鋼釘、起搏器等醫(yī)療器械而不能完善頭顱CT或MRI平掃，不能完善相關(guān)檢查。

1.2 分組資料 維吾爾族腦梗死50例，男32例，女18例，年齡54歲～76歲(62.42歲±0.99歲)；漢族腦梗死50例，男27例，女23例，年齡52歲～70歲(62.54歲±0.71歲)。所有病人均簽署知情同意書，且本研究已獲得新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院倫理委員會審查通過。

1.3 研究方法 病人了解本研究基本情況后，嚴(yán)格按照納入及排除標(biāo)準(zhǔn)，完善病人一般資料，如年齡、性別、民族、高血壓等。抽取病人空腹靜脈血5 mL，經(jīng)初步離心后放置于-80 ℃冰箱里，等待DNA檢測。

1.4 AOLX5AP基因檢測

1.4.1 引物的設(shè)計及擴(kuò)增(見表1)

表1 引物及引物序列

1.4.2 競爭性等位基因特異性PCR(Kompetitive Allele Specific，KASP PCR)實驗過程

1.4.2.1 實驗準(zhǔn)備 準(zhǔn)備DNA模板，將DNA模板稀釋至終濃度為1 ng/μL。

1.4.2.2 單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)檢測流程 第一輪PCR：完成SNP識別；第二輪PCR：完成把通用標(biāo)簽序列引入與SNP對應(yīng)的PCR產(chǎn)物；SNP熒光型號檢測：通過檢測FAM與HEX熒光，檢測SNP位點堿基。

1.4.2.3 熒光定量PCR儀進(jìn)行SNP分型檢測 PCR反應(yīng)程序結(jié)束后將樣本置于ABI Q6中檢測FAM及HEX熒光信號，檢測程序為反應(yīng)溫度30 ℃，時間為1 min，收集熒光信號，儀器根據(jù)每個樣本檢測的熒光信號值自動分型，Homozygous為純合子，Heterozygous為雜合子。

1.4.3 PCR直接測序驗證KASP分型結(jié)果 隨機(jī)挑選樣本進(jìn)行直接測序驗證KASP分型結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 漢族與維吾爾族病人臨床資料比較(見表2)

2.2 DNA提取結(jié)果(見圖1)

2.3 rs4293222位點分型圖譜(見圖2)

2.4 rs4293222位點測序峰圖 首先對特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再通過直接測序方式得到相應(yīng)的序列。詳見圖3。

2.5 維吾爾族和漢族腦梗死病人rs4293222位點基因型和等位基因頻率比較(見表3)

表2 兩組臨床資料比較

圖1 DNA提取電泳圖

圖2 rs4293222位點分型圖譜

圖3 rs4293222位點測序峰圖

3 討 論

腦梗死是神經(jīng)科常見的疾病，病因復(fù)雜，受多種因素影響[5]。一般認(rèn)為，高脂血癥、高血壓、吸煙、飲酒、糖尿病、肥胖及腦卒中家族史均為腦梗死的危險因素[6]。近幾年隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，有關(guān)腦梗死與諸多基因多態(tài)性的相關(guān)性探討日益受到重視[7]。

以往研究表明，炎癥是動脈粥樣硬化關(guān)鍵步驟的關(guān)鍵要素，為腦血管疾病的發(fā)病機(jī)制，包括ALOX5AP，這是由ALOX5AP基因編碼，是白三烯生物合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器(LTS)，導(dǎo)致其在脂肪沉積和動脈積累[8-9]。LTS引起白細(xì)胞激活和促進(jìn)血管壁單核細(xì)胞黏附，這一過程在動脈粥樣硬化和炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)制中起重要作用[10-11]。ALOX5AP基因與動脈粥樣硬化及斑塊發(fā)生發(fā)展具有明顯相關(guān)性，其突變率可提高該病的發(fā)生[12]。

ALOX5AP基因在炎癥過程中起著關(guān)鍵作用，白三烯是主要促炎因子，可促進(jìn)單核細(xì)胞與血管內(nèi)皮黏附，激活白細(xì)胞，同時增加血管通透性[13]。ALOX5AP基因某些位點產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)涉及多種心腦血管疾病發(fā)病[3，14-15]。國外臨床研究結(jié)果提示，ALOX5AP基因參與動脈粥樣硬化的病理生理過程，最終導(dǎo)致缺血性腦卒中[16]。與中國人口呈正相關(guān)ALOX5AP基因的某些位點與動脈粥樣硬化形成有關(guān)[17]。ALOX5AP基因在動脈粥樣硬化和炎癥性疾病中起重要作用。

表3 兩民族rs4293222位點基因型和等位基因頻率比較 例(%)

本研究采用病例-對照研究方法，利用PCR聚合酶鏈反應(yīng)和DNA基因測序法對100例腦梗死病人ALOX5AP基因rs4293222位點多態(tài)性的各基因型及等位基因頻率多態(tài)性進(jìn)行測定，比較新疆地區(qū)維吾爾族和漢族腦梗死病人不同基因型發(fā)生風(fēng)險的情況，結(jié)果顯示維吾爾族和漢族腦梗死病人性別、年齡、吸煙、高血壓史、糖尿病史比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，高脂血癥比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。維吾爾族人注重晚餐飲食，故其血脂、體重指數(shù)相對較高，而漢族高能量食物攝入較少，兩民族間飲食生活環(huán)境具有明顯相關(guān)，可對相關(guān)可控危險因素的指導(dǎo)提供數(shù)據(jù)支持。

本研究通過對維吾爾族和漢族rs4293222位點多態(tài)性進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)GG、GC、CC 3種基因型，進(jìn)而分析兩民族3種基因型頻率和C、G等位基因頻率分布情況，結(jié)果顯示：兩民族3種基因型總體分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.890，P=0.641)，C、G等位基因總體分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.739，P=0.390)。ALOX5AP基因rs4293222在缺血性中風(fēng)易感性發(fā)揮重要作用[18]，本研究結(jié)果與其不一致，分析可能是種族之間的差異。由于本研究樣本量有限，檢測方法受到多因素影響，并存在地域差異，因此尚需擴(kuò)大樣本量進(jìn)行新疆不同地區(qū)多中心臨床試驗研究，進(jìn)一步分析ALOX5AP基因rs4293222、rs4360791多態(tài)性與缺血性腦卒中的相關(guān)性，以明確篩選缺血性腦卒中的早期指標(biāo)，為預(yù)防和治療提供思路。