韓耕宇，李華福，許 宸，謝 群

(1珠海市人民醫(yī)院泌尿外科,廣東 珠海519000；2中山大學(xué)附屬第七醫(yī)院,廣東 深圳518102)

0 引言

膀胱癌作為全球第九大惡性腫瘤,每年有超過430 000新發(fā)人群［1］。在歐洲,同年發(fā)生的膀胱癌新發(fā)人群有118 000,每年死亡人數(shù)達(dá)到 52 000［2］。而在美國(guó),每年有超過70 980新發(fā)人群,每年死亡人數(shù)達(dá)到14 330［3］。75%的初發(fā)膀胱癌中有75%的患者為非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌(non-muscle invasive bladder cancer,NMIBC),主要治療手段包括經(jīng)尿道電切術(shù)(transuretheral resection,TUR)和膀胱灌注治療；還有25%的初發(fā)膀胱癌患者為非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌(muscle-invasive bladder cancer,MIBC),主要治療手段為膀胱癌根治術(shù)(radical cystectomy,RC)［4］。 NMIBC容易復(fù)發(fā)和進(jìn)展,而MIBC則更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移從而影響預(yù)后。MIBC行RC后其腫瘤特異死亡率仍為50%～70%［5］。 NMIBC 5年復(fù)發(fā)率為 30%～80%,進(jìn)展率為1%～45%［6］。雖然腫瘤的分級(jí)、分期對(duì)膀胱癌的治療與預(yù)后評(píng)估起重要作用,但這些指標(biāo)尚不能完全反映該腫瘤的生物學(xué)特性。不同侵襲性膀胱癌患者的生物學(xué)特征存在差異,這些差異可能是由不同基因的表達(dá)以及突變所引起。膀胱癌是一種多基因相關(guān)腫瘤,在機(jī)體內(nèi)在因素與外在因素的聯(lián)合作用下導(dǎo)致了膀胱癌的發(fā)生,是由細(xì)胞中基因的改變并積累而逐步形成的,細(xì)胞的癌變是一個(gè)十分復(fù)雜的過程［7］。分子生物學(xué)層面,膀胱癌變機(jī)制主要涉及癌基因激活及過度表達(dá)、抑癌基因突變及缺失、修復(fù)功能相關(guān)基因的功能喪失、在基因組中出現(xiàn)了核苷酸異常的串聯(lián)重復(fù),微衛(wèi)星不穩(wěn)定、調(diào)控信號(hào)傳導(dǎo)通路的功能紊亂、細(xì)胞端粒酶過度表達(dá)、細(xì)胞凋亡機(jī)制發(fā)生障礙以及出現(xiàn)浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移等相關(guān)分子事件［8］。而出現(xiàn)浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移等相關(guān)分子事件可能與不同侵襲性膀胱癌相關(guān),一些研究也發(fā)現(xiàn)某些基因在NMIBC中發(fā)生基因丟失的概率明顯低于浸潤(rùn)性膀胱癌,故認(rèn)為膀胱腫瘤的侵襲性可能與這些有著密切關(guān)系［9］。

探討不同侵襲性膀胱癌患者基因差異表達(dá),能夠?yàn)槲覀兠鞔_兩者的生物學(xué)特征,對(duì)靶向治療以及診斷具有重要的意義。因此本研究通過比較不同侵襲性膀胱癌患者的組織腫瘤細(xì)胞預(yù)后和基因表達(dá)譜,篩選與不同侵襲性膀胱癌患者相關(guān)的差異表達(dá)基因,并分析其涉及的關(guān)鍵通路,為尋找更準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、實(shí)用的生物標(biāo)記,鑒別診斷和指導(dǎo)個(gè)體化治療提供新思路。

1 材料和方法

基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)來源于基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(GEO,Gene Expression Omnibus,http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)［10］。 材料為膀胱癌組織,分離單個(gè)腫瘤細(xì)胞。采用Illumina公司出品的Illumina human-6 v2.0 expression beadchip生物芯片。GEO登陸號(hào)為 GSE13507［11］。 由 Seon-Kyu Kim 等提交,包括103例NMIBC患者,62例MIBC患者標(biāo)本。

采用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)的GEO2R在線分析工具進(jìn)行差異表達(dá)基因分析(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)。該工具基于R程序語(yǔ)言,利用R語(yǔ)言中GEOquery和limma程序包,應(yīng)用t檢驗(yàn)篩選差異表達(dá)基因［12］?；虮磉_(dá)譜數(shù)據(jù)具有高維度(檢測(cè)的基因數(shù)非常多,通常幾千甚至上萬(wàn))和小樣本量的特點(diǎn),需要多重假設(shè)檢驗(yàn)(Multiple test)控制。本研究中多重假設(shè)檢驗(yàn)控制采用 Benjamini和Hochberg提出的假陽(yáng)性率控制法［13］。差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)：P＜0.05,校正P值(adjustedP-value)＜0.05,基因表達(dá)值倍數(shù)變化(fold change,FC)≥1.5。最后通過信噪比(scalable profile,SNP)的差異進(jìn)行排序,用 pearson相關(guān)分析生成聚類分析熱圖,并用R語(yǔ)言進(jìn)行熱圖繪制。

利用UniHI數(shù)據(jù)庫(kù)(Unified Human Interactome database,http：//www.unihi.org/)找出與之能發(fā)生相互作用的蛋白質(zhì)［14］。分析其所編碼的蛋白之間的相互作用,然后在線作圖,刪除與其它蛋白無相互作用的節(jié)點(diǎn)后,調(diào)整圖中節(jié)點(diǎn)位置以充分暴露其互作網(wǎng)絡(luò)形態(tài),繪制差異基因互作網(wǎng)絡(luò)圖。

GEO數(shù)據(jù)庫(kù)膀胱癌患者的隨訪資料提供下載MINiML formatted family file(s)數(shù)據(jù),并使用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用Kaplan-Meier法計(jì)算總體生存率(overall survival,OS)和腫瘤特異死亡率(cancer specific mortality,csm),Log-Rank法比較OS的差異。不同分組的頻率分布和臨床病理特點(diǎn)采用Pearson's chisquare檢驗(yàn)?；颊叩囊话闱闆r見表1。

表1 NMIBC患者與MIBC患者一般情況

2 結(jié)果

NMIBC 患者1、3、5年 OS分別為90.3%、81.5%、72.19%；MIBC患者 1、3、5年 OS分別為 82.7%、49.1%、38.3%。兩組患者OS比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001),NMIBC的OS優(yōu)于MIBC患者(圖1)。NMIBC患者 1、3、5年 CSM 分別為 97.9%、96.3%、95.4%；MIBC 患者 1、3、5年 OS分別為 85.8%、55.7%、43.4%。兩組患者CSM差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001),NMIBC的CSM優(yōu)于MIBC患者(圖2)。

圖1 NMIBC與MIBC OS對(duì)比

圖2 NMIBC與MIBC CSM對(duì)比

NMIBC對(duì)比MIBC患者基因差異表達(dá)中上調(diào)有17個(gè),下調(diào)基因 8個(gè)(圖 3)。下調(diào)的基因包括S100A8、ACTG2、CALD1、FLNC、ATF3、MT2A、SLC2A3以及CTGF。上調(diào)的基因包括 ST3GAL5、CRTAC1、TESC、TMPRSS4、D4S234E、BTBD16、C10ORF99、CTSE、 LOC644844、 SPOCD1、 ANXA10、 SLC14A1、HSD17B2、KRT13、SYT8、FABP4 以及 HS.580308。

圖3 NMIBC對(duì)比MIBC患者基因差異表達(dá)熱圖

NMIBC對(duì)比MIBC差異表達(dá)基因中上調(diào)有17個(gè)基因構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò),除去孤立無互作的蛋白節(jié)點(diǎn),篩選出4個(gè)上調(diào)基因編碼的蛋白質(zhì)具有相互作用關(guān)系,基因圓圈大小代表該基因的影響分?jǐn)?shù),作用的大小以Interaction大小表示由圖4可知ATF3基因、CTGF基因、MT2A基因以及SLC2A3發(fā)揮重要的作用。NMIBC對(duì)比MIBC差異表達(dá)基因中下調(diào)有8個(gè)基因構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò),除去孤立無互作的蛋白節(jié)點(diǎn),篩選出2個(gè)下調(diào)基因編碼的蛋白質(zhì)具有相互作用關(guān)系,基因圓圈大小代表該基因的影響分?jǐn)?shù),作用的大小以Interaction大小表示,由圖5可知HSD17B2基因和FABP4基因發(fā)揮重要的作用。

圖4 上調(diào)基因編碼的蛋白質(zhì)相互作用圖

圖5 下調(diào)基因編碼的蛋白質(zhì)相互作用圖

3 討論

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,其中肌層浸潤(rùn)型膀胱癌易遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,預(yù)后較差。多種復(fù)雜分子機(jī)制參與膀胱癌的侵襲、轉(zhuǎn)移過程。腫瘤侵襲是各種腫瘤發(fā)展的重要過程,在膀胱移行細(xì)胞癌,癌細(xì)胞侵入肌層、血管或膀胱周圍組織的情況與膀胱癌的局部復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。一些蛋白質(zhì)可通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移、黏附、凋亡或腫瘤免疫等途徑影響腫瘤細(xì)胞的惡性程度、侵襲和轉(zhuǎn)移能力。所以,通過比較不同惡性程度的膀胱癌細(xì)胞系之間蛋白質(zhì)組的差異,可以發(fā)現(xiàn)一些與膀胱癌惡性程度相關(guān)的特異性蛋白質(zhì),深入了解這些蛋白質(zhì)的功能,將有利于促進(jìn)膀胱腫瘤診斷和治療的研究以及新藥物的開發(fā)。本研究利用基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(GEO)獲得包括 103例NMIBC患者和62例MIBC患者標(biāo)本,進(jìn)行差異表達(dá)基因分析、生存預(yù)后分析以及GSEA基因富集分析,發(fā)現(xiàn)NMIBC的CSM優(yōu)于MIBC患者,篩選出4個(gè)上調(diào)基因(ATF3基因、CTGF基因、MT2A基因以及SLC2A3)編碼的蛋白質(zhì)具有相互作用關(guān)系,篩選出2個(gè)下調(diào)基因(HSD17B2基因和FABP4基因)編碼的蛋白質(zhì)具有相互作用關(guān)系。

早期發(fā)現(xiàn)膀胱癌的侵襲性是臨床的一大挑戰(zhàn),大量的基于基因方面的研究希望能夠發(fā)現(xiàn)能夠早期預(yù)測(cè)膀胱癌侵襲性的基因或者標(biāo)志物,但是都存在一定的局限性［15］。本研究發(fā)現(xiàn) NMIBC對(duì)比 MIBC差異表達(dá)基因中上調(diào)的基因中,ATF3基因、CTGF基因、MT2A基因以及SLC2A3具有重要意義；下調(diào)的基因中,HSD17B2基因和FABP4基因具有重要意義。

ATF3基因(轉(zhuǎn)錄激活因子3)在正常靜息的細(xì)胞中表現(xiàn)為穩(wěn)態(tài)表達(dá),mRNA的基礎(chǔ)水平非常低,在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中,ATF3基因可被細(xì)胞因子、生長(zhǎng)刺激因子、病毒蛋白和信號(hào)分子誘導(dǎo)表達(dá)［16］。一些研究表明,ATF3基因在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期進(jìn)展中扮演重要角色,在多種腫瘤中呈高表達(dá),促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移,但其中的機(jī)制并不清楚［17］。 臧盛兵［18］等通過研究結(jié)直腸癌組織 ATF3基因表達(dá)的臨床意義分析時(shí)發(fā)現(xiàn),ATF3基因表達(dá)與結(jié)直腸癌的發(fā)生密切相關(guān),ATF3基因可能通過調(diào)控CyclinD1表達(dá)而促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移。但是ATF3基因在膀胱癌的作用可能會(huì)得出不一樣的結(jié)果。上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院檢驗(yàn)科沈立松教授領(lǐng)銜的科研團(tuán)隊(duì)在膀胱癌侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)A TF3是一種新的膀胱癌轉(zhuǎn)移抑制基因,并闡明了A TF3通過調(diào)控凝溶膠蛋白(gelsolin)介導(dǎo)的細(xì)胞骨架蛋白重構(gòu)抑制膀胱癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的新機(jī)制［19］。本研究也發(fā)現(xiàn)了NMIBC中ATF3基因表達(dá)上調(diào),說明ATF3基因的重要作用。

結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor,CTGF)是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-beta,TGF-β)的下游介質(zhì),具有明顯的有絲分裂原性和趨化性［20］。CTGF表達(dá)水平在纖維化組織中表達(dá)上調(diào)并且促進(jìn)其發(fā)展,并且與傷口的愈合、腫瘤發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)［21］。陳幕華等［22］通過研究甲狀腺組織CTGF基因的表達(dá)及其臨床意義發(fā)現(xiàn)CTGF在甲狀腺癌組織的高表達(dá)可能是腫瘤發(fā)生過程中的一個(gè)重要因素。但是該基因在膀胱癌中的作用尚未得到足夠的研究,其中對(duì)于NMIBC基因的上調(diào),需要未來更多的研究去證實(shí)。金屬硫蛋白(MT)是一類普遍存在于各種生物的富含半胱氨酸的小分子蛋白,其主要功能是重金屬離子解毒,調(diào)控金屬離子代謝、抗氧化。大量的研究發(fā)現(xiàn)它還具有調(diào)節(jié)細(xì)胞繁殖周期的作用,與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移有關(guān)［23］。 Kim 等［24］研究表明,MT-2A 過表達(dá)可以增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力,其調(diào)控機(jī)制是通過激活A(yù)P-1和 NF-κB因子進(jìn)而上調(diào)MMP-9蛋白實(shí)現(xiàn)的。MT-2A基因在膀胱癌中的作用尚未清晰,仍需更多的研究去支持。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3編碼基因 SLC2A3是SLC2A基因家族的一員,SLC2A3在多種類型癌癥細(xì)胞中均高表達(dá),如間充質(zhì)狀態(tài)的非小細(xì)胞肺癌和膠質(zhì)細(xì)胞瘤、喉鱗狀癌、低分化的子宮內(nèi)膜癌和乳腺癌中等［25］。高表達(dá)的SLC2A3與口腔癌的侵襲、大小、病理分期以及復(fù)發(fā)呈顯著正相關(guān)［26］。但SLC2A3基因在膀胱癌的相關(guān)研究尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

17β-羥甾類固醇脫氫酶(17-beta dehydrogenase1,HSD17B)屬于雌激素代謝酶,它參與調(diào)節(jié)組織中雄激素和雌激素水平。HSD17B2是NADPH依賴的氧化酶,它能催化高活性的17B-羥類固醇與低活性酮類固醇之間的轉(zhuǎn)換［27］。HSD17B2是雌二醇的失活轉(zhuǎn)變?yōu)榇萍に赝闹饕蛩?。HSD17B2同工酶可抑制肝臟、胎盤和子宮內(nèi)膜中的性類固醇激素。有研究表明接近80%的膀胱尿路上皮癌患者的癌組織中,都可以檢測(cè)到表達(dá)雌激素受體,表達(dá)的升高與膀胱癌的不良預(yù)后緊密相關(guān)［28］。 吳育棟等［29］通過探究雌激素及其受體抑制BCG療效的機(jī)制與淺表性膀胱癌復(fù)發(fā)的關(guān)系發(fā)現(xiàn)雌二醇可以抑制BCG與腫瘤細(xì)胞的粘附及進(jìn)入細(xì)胞從而降低BCG的療效。說明HSD17B2基因表達(dá)的下調(diào)可能是導(dǎo)致NMIBC預(yù)后較好的一個(gè)重要因素。脂肪酸結(jié)合蛋白(Fatty acidbinding proteins,FABPs)家族是一類參與脂類的運(yùn)輸、代謝和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)［30］。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),FABP4可能參與了脂肪組織對(duì)多種腹腔腫瘤的轉(zhuǎn)移促進(jìn)作用,包括乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、子宮內(nèi)膜癌、黑色素瘤等,機(jī)制可能為其參與脂肪為腫瘤供能或?qū)σ恍┫嚓P(guān)靶基因的表達(dá)調(diào)控［31］。Andersen等［32］發(fā)現(xiàn)FABP4基因的表達(dá)與膀胱癌的進(jìn)展有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)NMIBC基因下調(diào),說明該基因?qū)Π螂装┑那忠u性有一定的作用。

綜上所述,本研究利用GEO數(shù)據(jù)集,結(jié)合生物信息學(xué)分析方法,初步表明了ATF3基因、CTGF基因、MT2A基因以及SLC2A3在NMIBC樣本中的表達(dá)比在MIBC更高；可能是因?yàn)锳TF3基因通過調(diào)控凝溶膠蛋白(Gelsolin)介導(dǎo)的細(xì)胞骨架蛋白重構(gòu)抑制膀胱癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移,這可能也是NMIBC患者預(yù)后明顯高于MIBC的原因。但是CTGF基因、MT2A基因以及SLC2A3基因在其他一些腫瘤中的表達(dá)往往與預(yù)后相關(guān),與本研究得出的結(jié)果有差異,其中的原理尚需我們進(jìn)一步驗(yàn)證。HSD17B2基因和FABP4基因在MIBC樣本中的表達(dá)比在NMIBC中更高,HSD17B2基因的上調(diào)可以使雌激素受體激活,從而降低膀胱癌對(duì)于灌注化療的敏感性,這可能是影響其預(yù)后的重要因素。而FABP4基因的過度表達(dá)與腫瘤的侵襲性有重要關(guān)系,這也是其中的一個(gè)重要原因。本研究只是從生物信息學(xué)的角度進(jìn)行分析,可能存在一定的偏差,其中的一些機(jī)制以及基因表達(dá)的研究需要更多的實(shí)驗(yàn)繼續(xù)去驗(yàn)證。