呂蘭欣，顏曉慶，楊紅寧，韓 東，胡書群

(徐州醫(yī)科大學衛(wèi)生應急研究所,徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院急救中心,江蘇徐州221002)

0 引言

由于疾病、車禍、自然災害等原因引起的大尺寸長骨缺損日益增多,其修復問題一直是困擾臨床治療的難題,組織工程概念的提出為這一問題的解決提供了可能［1］。經(jīng)過近四十年的發(fā)展,骨組織工程研究已經(jīng)取得了很大進展,大量的可降解生物材料用于制備組織工程支架,其中聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(poly lactic-co-glycolic acid,PLGA)因其降解速率可調(diào)以及良好的生物相容性而獲得廣泛關注［2－4］。PLGA多孔支架具有高孔隙率和聯(lián)通性,有利于細胞長入以及營養(yǎng)物質(zhì)輸送,在骨組織工程中被大量研究［5－6］。 然而,目前大部分骨組織工程的體外實驗都是靜態(tài)培養(yǎng),與體內(nèi)環(huán)境差異較大。 有研究［7－8］表明,動態(tài)培養(yǎng)如壓力刺激等能夠模擬體內(nèi)環(huán)境,促進干細胞向成骨細胞分化,加速骨再生。本研究將微流控法與顆粒瀝濾法相結合,制備PLGA多孔支架,與人骨髓間充質(zhì)干細胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)和人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)共培養(yǎng)于壓力型生物反應器中,研究壓力刺激對共培養(yǎng)系統(tǒng)成骨作用的影響,進一步的,將壓力刺激后的組織工程骨替代物植入雞尿囊胚模型中,觀察其成骨效果。

1 資料和方法

1.1 材料本實驗所用hMSCs購自LONZA,HUVECs購自GIBCO；所用PLGA購自Sigma；細胞培養(yǎng)所需試劑均購自 Hyclone；細胞培養(yǎng)耗材均購自NUNC；細胞示蹤染料PKH26購自Sigma；所用CCK-8試劑盒購自VICMED；羊抗人CD31一抗以及FITC標記的驢抗羊二抗均購自Santa Cruz。

1.2 方法

1.2.1 PLGA多孔支架制備 PLGA多孔支架的制備參照以前發(fā)表的文章進行［9］。簡單介紹如下,利用本實驗室搭設的微流控設備制備直徑為300 μm左右的明膠微球,自組裝法獲得規(guī)則排列的具有蛋白石結構的明膠微球模板；將10%wt/v的PLGA溶液傾注于規(guī)則排列的明膠微球模板上,－20℃速凍2 h后冷凍干燥過夜去除溶劑；45℃水浴中攪拌過夜去除明膠微球,獲得具有規(guī)則形貌的PLGA多孔支架。支架浸泡于70%的酒精中2 h轉(zhuǎn)移至超凈工作臺,用磷酸鹽緩沖液沖洗3次風干備用。

1.2.2 細胞培養(yǎng) 將第3代hMSCs離心5 min收集,用PKH26染色試劑盒對其進行示蹤染色。具體步驟按說明書進行,簡述如下：將收集的hMSCs用無血清培養(yǎng)基洗兩遍,按1∶1將PKH26染液與稀釋液C混合獲得染料工作液,將工作液按1∶250的濃度加入稀釋液C中與hMSCs混勻室溫孵育10 min。加入等體積血清終止染色,用PBS洗3次獲得熒光標記的hMSCs,計數(shù)備用。

收集HUVECs,將兩種細胞按以下比例進行混合,hMSCs∶HUVECs＝9 ∶1,以2×106/mL的濃度接種于PLGA多孔支架,進行靜態(tài)培養(yǎng),獲得組織工程骨替代物。于接種后第1、3、7天用激光共聚焦顯微鏡觀察細胞分布情況,第 3、5、7、9天用 CCK-8檢測細胞增殖情況。

1.2.3 壓力刺激 靜態(tài)培養(yǎng)10 d后,將支架-細胞復合物轉(zhuǎn)移至六孔板中,用專用的壓力型生物反應器進行刺激,刺激頻率為1 Hz,每次壓力刺激時間為1 h,每天進行一次,共7 d。

動態(tài)培養(yǎng)7 d后取部分樣品進行檢測,micro-CT用來檢測支架-細胞復合物經(jīng)壓力刺激后的成骨情況,掃描過程按照說明書以及儀器配置的軟件進行。首先,將PLGA多孔支架作為空白對照進行掃描,分辨率為8 μm,確定鈣化閾值為190,PLGA支架閾值為110。然后將靜態(tài)培養(yǎng)和動態(tài)培養(yǎng)的支架-細胞復合物分別進行掃描,選擇閾值190以上為鈣化區(qū)域,110以下為PLGA支架區(qū)域。

掃描完成后,立即將支架-細胞復合物取出進行免疫熒光染色。4%多聚甲醛固定后用3%牛血清白蛋白封閉1 h,羊抗人CD31一抗稀釋100倍4℃孵育過夜,PBS洗2次后加FITC標記的驢抗羊二抗進行室溫孵育2 h,最后加入DAPI進行細胞核染色,用激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.4 CAM實驗 將動態(tài)培養(yǎng)7 d后的組織工程骨替代物植入雞尿囊胚模型(CAM)中,37℃孵育7 d,取出后用4%多聚甲醛固定30 min,用micro-CT來檢測壓力刺激后的支架-細胞復合物在模擬體內(nèi)環(huán)境中的成骨情況,掃描過程按照說明書以及儀器配置的軟件進行,具體同上。

1.3 統(tǒng)計學處理實驗數(shù)據(jù)使用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進行分析,分析結果均以±s表示。統(tǒng)計采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)；兩組比較時采用Student'st-test,P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 細胞增殖及活性

2.1.1 細胞示蹤 圖1為PKH26染料對hMSCs進行細胞膜染色示蹤結果,接種后第1、3、7天激光共聚焦顯微鏡觀察,可見紅色熒光顯著增多,hMSCs在觀察期增殖顯著,表明PLGA多孔支架具有較好的細胞相容性。

圖1 hMSCs接種于PLGA多孔支架后第1、3、7天激光共聚焦顯微鏡觀察結果

2.1.2 細胞增殖 圖2為細胞接種后第3、5、7、9天CCK-8檢測結果,可見在相應的檢測時間點,吸光值逐漸增加,細胞增殖明顯,這一結果與細胞示蹤結果一致。

圖2 hMSCs/HUVECs接種于 PLGA 多孔支架第 3、5、7、9天CCK-8檢測結果

2.2 壓力刺激對骨替代物構建的作用

2.2.1 PLGA多孔支架鈣沉積 為檢測壓力刺激對細胞-支架復合物成骨的影響,在動態(tài)培養(yǎng)1周后進行了micro-CT檢測。圖3為micro-CT檢測細胞-支架復合物在動態(tài)培養(yǎng)1周后的鈣沉積情況。其中圖3A為細胞-支架復合物靜態(tài)培養(yǎng),可見紅色區(qū)域接近于0,表明hMSCs幾乎沒有成骨分化；而圖3B為動態(tài)培養(yǎng),可見有較為明顯的紅色區(qū)域,表明接種于PLGA多孔支架的hMSCs在壓力刺激下可以向成骨細胞分化,并且在2周左右即出現(xiàn)明顯鈣沉積。

圖3 Micro-CT檢測PLGA多孔支架接種hMSCs并經(jīng)壓力刺激一周后的鈣沉積情況

2.2.2 血管化 為檢測壓力刺激對細胞-支架復合物成血管的影響,在動態(tài)培養(yǎng)1周后進行了CD31染色。圖4為細胞-支架復合物動態(tài)培養(yǎng)1周后CD31免疫熒光染色結果,其中圖4A1～A4為靜態(tài)培養(yǎng)組,圖4B1～B4為動態(tài)培養(yǎng)組。由CD31綠色熒光染色可見,兩組之間并沒有顯著差異,表明壓力刺激對血管生成沒有顯著作用。

圖4 細胞-支架復合物在動態(tài)培養(yǎng)1周后CD31免疫熒光染色結果

2.2.3 CAM培養(yǎng)后的鈣沉積 為模擬體內(nèi)環(huán)境,制備了CAM模型,將靜態(tài)和動態(tài)培養(yǎng)的細胞-支架復合物植入其中,培養(yǎng)7 d后對其鈣沉積狀況進行了檢測。由圖可見在CAM模型中細胞-支架復合物的鈣沉積情況明顯優(yōu)于體外培養(yǎng)組,并且壓力刺激組鈣沉積顯著優(yōu)于靜態(tài)培養(yǎng)組(圖5)。這一結果表明在模擬體內(nèi)環(huán)境中,壓力刺激能夠顯著提高細胞-支架復合物的鈣沉積。

圖5 細胞-支架復合物在CAM模型中培養(yǎng)7 d后檢測鈣沉積結果

3 討論

骨組織工程研究為大片段骨缺損修復提供了可能。目前骨組織工程研究主要集中在骨組織工程支架設計以及誘導因子緩釋上,在體外誘導干細胞成骨分化以及體內(nèi)誘導骨再生方面取得了良好進展［10－12］。 在骨組織工程支架材料選取上,很多生物材料因其組織相容性好以及可降解特性被廣泛關注,如PLGA、聚氨酯類(PHA)等；在支架設計上,多孔支架因為具有很好的孔隙率和聯(lián)通性,有利于氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)運輸,有利于細胞和組織長入而被廣泛關注和研究［13－16］。 多孔支架的制備方法很多,如鹽顆粒瀝濾、冷凍干燥、相分離等,其中研究［1,17－18］報道的明膠微球瀝濾法可以獲得孔徑十分均一,且聯(lián)通性極佳的多孔支架,并且不會因鹽顆粒的殘留影響后續(xù)研究,是一種有良好應用前景的骨組織工程支架制備方法。本研究采用微流控裝置收集了直徑300 μm左右(304.5±12.7 μm)的明膠微球,將其整齊排列成各微球間緊密連接的三維模板,采用溶劑流延顆粒瀝濾法獲得PLGA多孔支架,孔隙聯(lián)通性接近100%,孔徑大小適宜且均一性好,有報道［9］稱此尺寸的孔徑有利于血管長入以及快速成骨。PLGA是一種FDA認證的生物材料,具有良好的相容性,降解速率可調(diào),被廣泛應用于骨組織工程研究中。本研究通過細胞示蹤技術以及細胞活性檢測也表明,PLGA多孔支架具有很好的細胞相容性,hMSCs與HUVECs聯(lián)合種植于PLGA多孔支架可以獲得細胞-支架復合物。

雖然目前骨組織工程研究很多,但大部分都是直接將支架與細胞結合植入體內(nèi)研究其成骨效果,其成骨速度較慢［3］。 有研究［7］聚焦于快速成骨,探討了壓力刺激對于成骨的促進作用。各種生物反應器也用于研究組織工程骨替代物的構建,加速骨缺損的修復,如灌注型生物反應器(perfusion-based bioreactor systems)、旋轉(zhuǎn)型生物反應器(spinner flask bioreactor,rotating bioreactor systems)、壓力型生物反應器(direct mechanical strain system)［19］。 本研究采用了壓力型生物反應器對細胞-支架復合物進行間歇性壓力刺激,結果表明與普通的靜態(tài)培養(yǎng)法相比,該方法可以有效提高hMSCs的成骨能力；進一步通過CAM模型來模擬體內(nèi)環(huán)境進行研究,發(fā)現(xiàn)壓力刺激后的細胞-支架復合物能夠產(chǎn)生更多的鈣沉積,這也表明壓力刺激可以有效提高組織工程骨替代物構建的速度,預示著壓力刺激后的骨組織工程替代物在植入體內(nèi)后能夠更快地成骨,縮短骨缺損修復的時間。Reinwald等［20］報道壓力刺激作用下,人骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)于靜電紡絲納米纖維基底,成骨標志物Ⅰ型膠原、堿性磷酸酶,以及Runx2均顯著上調(diào)。這與本研究結果相一致。

血管化情況對于骨組織工程替代物能否有效促進骨缺損修復有重要參考價值,因為血管長入后可以將氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)運輸至多孔支架內(nèi)部,會加快骨再生速度［21］。有很多血管生長因子被引入骨組織工程支架中以期達到促血管新生的目的［22－23］。 有研究［4,24］將內(nèi)皮細胞與干細胞共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞可以促進干細胞表達新生血管標志物CD31。本研究通過將hMSCs與HUVECs共培養(yǎng)于PLGA多孔支架形成細胞-支架復合物,分別進行動態(tài)培養(yǎng)和靜態(tài)培養(yǎng)后進行CD31染色,檢測復合物血管化情況,結果顯示靜態(tài)培養(yǎng)和動態(tài)培養(yǎng)組CD31的表達均較高,但是二者之間并無明顯差異。這一結果表明,HUVECs與hMSCs共培養(yǎng)能夠提高CD31表達,但壓力刺激對于血管化并無明顯助益。理論上血管生成是血液輸送的需求所驅(qū)動,研究［3］發(fā)現(xiàn),三維支架植入動物體內(nèi)后新生血管可以長入支架內(nèi)部,本研究暫未發(fā)現(xiàn)壓力刺激對血管化的顯著作用,后續(xù)我們將進一步進行動物實驗來研究在有血液輸送需求的情況下動態(tài)培養(yǎng)和靜態(tài)培養(yǎng)對于血管新生的作用差異。

綜上所述,本研究將hMSCs與HUVECs共培養(yǎng)于PLGA多孔支架形成細胞-支架復合物,通過體外培養(yǎng)及壓力刺激構建了組織工程骨替代物,在模擬體內(nèi)環(huán)境的CAM模型中對其進行培養(yǎng),可以實現(xiàn)快速骨化,是一種有潛在應用前景的組織工程骨替代物。