白冷媚，謝傳美

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院風(fēng)濕科，四川 南充 637000)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種以多系統(tǒng)損害為主要臨床表現(xiàn)，以多種特異性自身抗體陽(yáng)性為主要實(shí)驗(yàn)室特征的慢性自身免疫性疾病。目前研究顯示其病因及發(fā)病機(jī)制可能與環(huán)境因素、基因、固有免疫和獲得性免疫、特定的器官損害有關(guān)[1]。

隨著研究深入，發(fā)現(xiàn)許多細(xì)胞因子(IL-6、IL-17等)參與免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展，且已在風(fēng)濕病中進(jìn)行了臨床試驗(yàn)[2]。近年來又發(fā)現(xiàn)一些新的抗原如CD28、可誘導(dǎo)共信號(hào)分子(inducible co-stimulator，ICOS)、程序性壞死分子1(programmed death-1，PD-1)和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4，CTLA-4/CD152)這樣的共信號(hào)分子，它們?cè)赟LE等多領(lǐng)域的疾病中均異常表達(dá)，通過阻斷上述共信號(hào)分子通路作為免疫系統(tǒng)疾病的靶點(diǎn)治療，或可成為一種新型的治療方案。CD28和ICOS是正性共信號(hào)分子[3](共刺激分子)，主要參與激活T細(xì)胞；PD-1及CTLA-4作為負(fù)性共信號(hào)分子[4](共抑制分子)，主要抑制淋巴細(xì)胞活化，它們的共同作用維持著體內(nèi)免疫應(yīng)答及免疫耐受的平衡。查閱國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，部分上述共信號(hào)分子在SLE患者外周血中的表達(dá)水平尚有爭(zhēng)議。

基于目前國(guó)內(nèi)外的文獻(xiàn)資料，涉及同一患者活躍期與非活躍期自身對(duì)照的研究還很少，故擬采用FCM檢測(cè)CD28、ICOS、PD-1、CTLA-4在SLE患者活躍期外周血中CD4+T細(xì)胞上的表達(dá)水平，并與自身對(duì)照組及健康對(duì)照組比較，探討上述共信號(hào)分子是否與疾病活動(dòng)度有關(guān)，以此初步推測(cè)在上述4種共信號(hào)分子中哪1種或哪幾種共信號(hào)分子占主導(dǎo)地位。

1 材料與方法

1.1 研究方法

本研究采用病例對(duì)照研究，應(yīng)用免疫熒光標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)20例SLE活躍期患者及30名健康體檢者外周血CD4+T細(xì)胞表面上CD28、ICOS、PD-1、CTLA-4的表達(dá)水平，并以上述狼瘡患者非活躍期作為自身對(duì)照，同時(shí)統(tǒng)計(jì)所有受試者的基本資料、各項(xiàng)臨床數(shù)據(jù)及實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果，分析各實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)之間的差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以及共信號(hào)分子與疾病活動(dòng)度的相關(guān)性。

1.2 研究對(duì)象

收集2015年6月至2017年11月川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院風(fēng)濕血液科住院及門診20例SLE患者。

應(yīng)用免疫熒光標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各受試者外周血CD4+T細(xì)胞上4種共信號(hào)分子的表達(dá)水平。其中女性18例，男性2例，年齡10～57歲，平均(38.50±13.10)歲，病程0～20年，平均(3.9±4.52)年(其中15例為初診患者)，活躍期SLE患者SLEDAI評(píng)分均≥10分平均(15.3±4.18)分。非活躍期患者SLEDAI評(píng)分均≤6分平均(3.9±1.33)分；健康對(duì)照組為30名女性健康體檢者，年齡24～63歲，平均(35.67±11.82)歲。各組間性別、年齡無顯著性差異。所有患者均符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(ACR)1997年修訂的SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，排除合并以下疾病的患者：(1)感染；(2)惡性腫瘤、慢性腎炎、甲狀腺疾病等；(3)重疊綜合征。同時(shí)記錄所有SLE患者的一般資料，包括癥狀、體征、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果、影像學(xué)檢查結(jié)果等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 外周血的采集和保存 所有受試者均清晨空腹采集外周血標(biāo)本1 mL，室溫下EDTA抗凝，及時(shí)(6 h內(nèi))行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

1.3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血CD4+T細(xì)胞上CD28、ICOS、PD-1、CTLA-4的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

結(jié)果顯示，在活躍期組、非活躍期組及健康對(duì)照組外周血CD4+T淋巴細(xì)胞上，4種共信號(hào)分子(CD28、ICOS、PD-1、CTLA-4)均表達(dá)。

2.1 CD28

活躍期組外周血CD4+T細(xì)胞上CD28的表達(dá)為(46.53±14.55)%，與健康對(duì)照組[(40.78±14.51)%]比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.176，P>0.05)，與自身對(duì)照組[(31.39±16.29)%]比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.045，P<0.05)，活躍期組高表達(dá)。見圖1。

2.2 ICOS

活躍期組與健康組、自身對(duì)照組ICOS的表達(dá)分別為(1.9±0.98)%、(1.76±1.18)%、(1.749±0.67)%，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.6839，P>0.05；P=0.5863，P>0.05)。見圖2。

2.3 PD-1

活躍期組PD-1的表達(dá)為(10.88±4.09)%，較健康組(4.65±3.08)%顯著升高(P<0.001)，與自身對(duì)照組(6.67±4.00)%比較也有顯著差異(P=0.002)。見圖3。

2.4 CTLA-4

活躍期組(0.16±0.13)%與健康組(0.67±0.83)%比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.008，P<0.01)；非活躍期組(0.17±0.13)%與健康組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.01，P<0.05)；但20例自身對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.724，P>0.05)。見圖4。

經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，CD28、ICOS的表達(dá)與SLEDAI呈正相關(guān)性，PD-1、CTLA-4的表達(dá)與SLEDAI呈負(fù)相關(guān)性，但4種共信號(hào)分子與SLEDAI均無明顯相關(guān)性(表1，圖5-圖6)。

表1外周血CD4+T細(xì)胞上4種共信號(hào)分子表達(dá)水平與SLEDAI的相關(guān)性

組別r值(Spearman)CD28 vs SLEDAI0.110 609ICOS vs SLEDAI0.047 729PD-1 vs SLEDAI-0.280 311 CTLA-4 vs SLEDAI-0.050 058

上述4種共信號(hào)分子與SLEDAI的|r|均<0.3。

3 討論

人體獲得性免疫應(yīng)答和造血?jiǎng)討B(tài)平衡的維持需要T淋巴細(xì)胞增殖的精確調(diào)節(jié)，要完全激活靜止的T細(xì)胞需要CD28、ICOS這樣的受體，而抑制淋巴細(xì)胞活化則需要PD-1和CTLA-4這樣的受體轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)。這種正/負(fù)信號(hào)的平衡能夠在維持機(jī)體免疫耐受的同時(shí)保證有效的免疫應(yīng)答以及防止自身免疫[4]。

CD28通過激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)，影響細(xì)胞因子的合成和存活[4]，同時(shí)促進(jìn)T 細(xì)胞活化、IL-2生產(chǎn)和 T 細(xì)胞的存活[6]。

在本實(shí)驗(yàn)中，僅自身對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(活躍期組高表達(dá))。既往有研究顯示CD28在患者血清中高表達(dá)，但與SLEDAI評(píng)分無相關(guān)性[7-8]。而1996年的一項(xiàng)研究指出狼瘡患者CD28+T細(xì)胞選擇性降低，且是由于CD28-介導(dǎo)的協(xié)同信號(hào)影響了T細(xì)胞對(duì)激活誘導(dǎo)細(xì)胞死亡(activation-induced cell death，AICD)的易感性[9]。本實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯示自身對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但由于樣本量較少，上述結(jié)果是否有意義尚不明確。現(xiàn)有文獻(xiàn)中，Bijl等[10]的一項(xiàng)類似研究與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近，除結(jié)果外，該研究與本實(shí)驗(yàn)相似處還在于樣本量也較少，故在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中可通過進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量來證實(shí)CD28是否異常表達(dá)。

同樣作為共信號(hào)分子的ICOS有24%氨基酸序列與CD28同源， CD28可增強(qiáng)ICOS的表達(dá)，當(dāng)缺乏CD28的配體B7-1和B7-2時(shí)其表達(dá)的上調(diào)則顯著降低，故據(jù)此推測(cè)ICOS可能為活化后的T細(xì)胞提供共刺激信號(hào)[6]。雖然ICOS的表達(dá)水平是否存在差異仍有爭(zhēng)議，但有文獻(xiàn)顯示ICOS在SLE患者中高表達(dá)[10-13]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ICOS的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與CD28的檢測(cè)結(jié)果一致。查閱國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，二者的表達(dá)有一致性，由于本實(shí)驗(yàn)是使用同一樣本同時(shí)檢測(cè)4種共信號(hào)分子，那么上述檢測(cè)結(jié)果是否可以用ICOS與CD28的一致性來解釋，或仍然是由于樣本量少而使得陽(yáng)性結(jié)果尚不能被檢測(cè)出來？要證實(shí)上述猜測(cè)仍需要進(jìn)一步收集樣本量來解決。

PD-1亦屬于免疫球蛋白超家族，它通過阻止CD28介導(dǎo)的磷脂酰肌醇3-激酶活化來抑制蛋白激酶磷酸化，從而對(duì)T細(xì)胞活化起負(fù)性調(diào)節(jié)作用。SLE以T細(xì)胞的異?；罨癁樘卣?，機(jī)體為維持免疫平衡增加PD-1的表達(dá)，從而達(dá)到負(fù)性調(diào)節(jié)的作用。同時(shí)也有研究證實(shí)缺失PD-1的小鼠更容易患自身免疫性疾病[4，14-18]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PD-1在SLE患者中較健康對(duì)照組顯著高表達(dá)，且活躍期組較對(duì)照組仍高表達(dá)，這一結(jié)果與既往文獻(xiàn)相符[17]。

CTLA-4的作用機(jī)制尚未研究清楚，但多項(xiàng)研究已經(jīng)證實(shí)其主要功能是下調(diào)T細(xì)胞反應(yīng)。早年Liu等[19-20]的研究發(fā)現(xiàn)與健康對(duì)照組相比，SLE患者CTLA-4陽(yáng)性T細(xì)胞的百分比顯著增加。但其后的一項(xiàng)研究顯示在誘導(dǎo)后SLE患者表達(dá)的T細(xì)胞中，CTLA-4的表達(dá)較健康對(duì)照組低。隨后Lee等[21]發(fā)現(xiàn)在活躍期SLE患者中，CD4+CD25+Treg細(xì)胞的百分比較非活躍期SLE患者及健康對(duì)照組顯著降低，同時(shí)發(fā)現(xiàn)在活躍期SLE患者外周血PBMCs中，CD4+T細(xì)胞上CTLA-4的表達(dá)較非活躍期及健康組升高，由于CD4+T細(xì)胞上CTLA-4的優(yōu)先表達(dá)主要受限于Treg細(xì)胞，由此推測(cè)CTLA-4的表達(dá)可能與活躍期SLE患者免疫防控功能所致的Treg細(xì)胞介導(dǎo)的抑制功能活化相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示活躍組組CTLA-4較健康組低表達(dá)，而自身對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。曾有文獻(xiàn)報(bào)道在小鼠的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，刺激后的CTLA-4相較于細(xì)胞表面，更多的是在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)[22]，同時(shí)也有研究推測(cè)其低表達(dá)可能是由于CTLA-4為瞬時(shí)表達(dá)并快速的進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)[23-24]，那么通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面的CTLA-4的表達(dá)便尤為困難，或許這可以解釋為何在SLE患者外周血CD4+T細(xì)胞表面上CTLA-4的表達(dá)是降低的，同時(shí)也不排除其低表達(dá)是否與SLE患者CTLA-4分子下調(diào)功能的受損或與“T細(xì)胞耗竭”有關(guān)。要證實(shí)上述觀點(diǎn)仍需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)或其他實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法。