盛竹鴿，郭劍，梁愛玲，王宇暉，朱浪潮，王瑩，劉利平

(渭南市中心醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西 渭南 714000)

腸道是人體中最大的內(nèi)毒素、細菌貯存庫，可通過體液免疫和細胞免疫共同防御各種有害因素對機體的侵犯，特別是腸黏膜屏障可有效防止腸腔內(nèi)多種有害物質(zhì)穿越腸黏膜進入血液循環(huán)，引起其他組織器官損傷[1-2]。腸道巨噬細胞是腸黏膜屏障重要的組成部分，源于骨髓中造血干細胞，主要存在于腸上皮下的固有層中，可參與機體固有免疫反應(yīng)，具有殺傷及吞噬功能[3-4]。在病理狀態(tài)下，腸道巨噬細胞可釋放大量的炎癥因子，可以進入血循環(huán)，作用于肝、肺、腎等器官組織并引起損傷[5]。特別是脂多糖(LPS)可以與細胞表面受體結(jié)合而激活這一途徑，影響腸黏膜屏障通透性，造成腸屏障功能障礙[6-7]。髓系細胞觸發(fā)受體-1(triggering receptor expressed on myeloid cells-1，TREM-1)是當前發(fā)現(xiàn)的細胞表面分子，是選擇性表達在CD14+單核細胞及中性粒細胞等髓系細胞表面的炎癥受體，可參與促炎因子的合成釋放，能夠放大炎癥的級聯(lián)反應(yīng)[8-9]。17個氨基酸組成的多肽(LP17)是TREM-1拮抗劑，含有TREM-1天然的CDR2、CDR3序列的至少3個氨基酸，可減少炎癥介質(zhì)的釋放[10-11]。本研究采用LPS體外刺激腸巨噬細胞，應(yīng)用TREM-1拮抗劑-LP17來干預(yù)腸巨噬細胞內(nèi)TREM-1的表達，探討TREM-1的拮抗劑對大鼠腸巨噬細胞超微結(jié)構(gòu)的影響，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

健康雄性SD大鼠由本院動物實驗動心提供，質(zhì)量0.2～0.25 kg，實驗符合動物倫理要求，批準號：[SCXK()2012-0004]，9周齡，實驗前予以禁食12 h、禁水4 h，保持腸道清潔。 LP17多肽由上海潔而生化合成，LPS購自美國sigma公司。RPMI-1640培養(yǎng)基、FBS購自美國Hyelone公司；細胞培養(yǎng)板購自美國Corning公司。

1.2 大鼠腸巨噬細胞的分離培養(yǎng)與鑒定

大鼠用尾靜脈注射0.3%戊巴比妥鈉麻醉。選擇腹部正中切口，顯露全部小腸，沿系膜快速切取全部小腸，PBS沖洗腸管，沿小腸系膜縱向分段剖開，用Hanks平衡鹽溶液，振蕩培養(yǎng)60 min后采用用膠原酶Ⅳ繼續(xù)消化2 h，不銹鋼400目篩網(wǎng)進行過濾，1 500 rpm 4 ℃ 離心20 min收集細胞。 計數(shù)大腸巨噬細胞，以RPMI1 640培養(yǎng)基進行分離培養(yǎng)。采用一抗Rabbit polyclonal to CD14(1∶300)進行鑒定分析，二抗為Goat anti—Rabbit IgG(H+L)，于熒光顯微鏡下觀察并拍照，陽性信號為綠色熒光。

1.3 大鼠腸巨噬細胞的分組處理

大鼠腸巨噬細胞分為3組，對照組：未加LPS 和LP17；LPS組：LPS給藥濃度為1 mg/L；治療組：LPS給藥濃度為1 mg/L，LP17給藥濃度為0.1 mg/L。

1.4 MTT法檢測細胞活力

將分離好的大鼠腸巨噬細胞按照2×104個細胞的接種密度接種至96孔板中，生長到對數(shù)生長期進行上述處理，每個濃度3個復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后每孔加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入二甲基亞砜后進行震蕩10 min，采用酶標儀在490 nm處測定各孔的吸光值(OD值)，計算細胞活力。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡

收集處理48 h后的大鼠腸巨噬細胞，采用預(yù)冰冷70%的乙醇固定，使用PBS重懸5 min，400目篩網(wǎng)過濾。然后4 ℃避光30 min，流式細胞儀檢測與計算細胞凋亡情況。

1.6 Western blot檢測細胞TREM-1和TNF-α表達

收集處理48 h后的大鼠腸巨噬細胞，提出總蛋白，用Western blot檢測TREM-1和TNF-α 蛋白表達。

1.7 電鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu)

收集處理48 h后的大鼠腸巨噬細胞，經(jīng)2.5% 戊二醛前固定2 h，再經(jīng)常規(guī)脫水、透明、樹脂浸透包埋，制成70 nm切片組織，經(jīng)檸檬酸鉛染色后在透射電鏡上觀察拍照。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 細胞分離培養(yǎng)、鑒定及活力比較

大鼠腸巨噬細胞生長狀態(tài)良好，免疫熒光顯示為綠色熒光，CD14表達陽性，細胞分布較均勻，見圖1。治療組與對照組的細胞活力指數(shù)顯著高于LPS組(P<0.05)，治療組與對照組對比，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組大鼠腸巨噬細胞活力指數(shù)比較

*P<0.05，與LPS組比較。

2.2 細胞凋亡指數(shù)比較

治療組與對照組的細胞凋亡指數(shù)顯著低于LPS組(P<0.05)，治療組與對照組對比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 3組大鼠腸巨噬細胞凋亡指數(shù)對比

組別n細胞凋亡指數(shù)(x-±s)對照組32.19±0.22LPS組321.43±1.83治療組33.28±0.84

*P<0.05，與LPS組比較。

2.3 TREM-1、TNF-α的表達

治療組與對照組的TREM-1、TNF-α相對表達量顯著低于LPS組(P<0.05)，治療組與對照組對比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2。

2.4 細胞超微結(jié)構(gòu)對比

電鏡下觀察對照組腸微絨毛整齊排列，巨噬細胞形態(tài)規(guī)則；LPS組發(fā)現(xiàn)腸巨噬細胞內(nèi)出現(xiàn)大量凋亡小體，巨噬細胞體積增大，突起，胞間連接紊亂斷裂；治療組發(fā)現(xiàn)腸巨噬細胞內(nèi)出現(xiàn)邵愛玲凋亡小體，腸上皮細胞間隙恢復(fù)正常，巨噬細胞表面突起、偽足少。見圖3。

3 討論

腸黏膜中腸巨噬細胞、樹突狀細胞構(gòu)成了腸道防止感染的重要防線，在腸黏膜屏障中占重要作用，確保保護性免疫反應(yīng)[12]。在機體損傷與發(fā)生感染時，可出現(xiàn)腸黏膜上皮水腫，產(chǎn)生大量酸性代謝產(chǎn)物，細胞間連接斷裂，使腸黏膜血管舒縮紊亂，進一步損傷腸黏膜上皮。特別是腸巨噬細胞的活化可產(chǎn)生大量促炎因子，形成炎癥級聯(lián)放大反應(yīng)，引起腸黏膜通透性增加[13]。

巨噬細胞在先天性免疫、腫瘤、炎癥中發(fā)揮重要作用，其在炎癥反應(yīng)早期階段可起到吞噬細菌及殺滅抗原的作用，也在腫瘤的形成中有一定促進作用[14]。LPS可引起黏膜下水腫，腸上皮絨毛出現(xiàn)壞死，通透性增加，血流量減少，并可誘導(dǎo)炎癥因子等釋放，引起腸黏膜屏障損傷[15]。LP17為TREM-1特異性拮抗劑，可有效阻斷感染性休克模型大鼠TREM-1通路，并顯著減輕腸屏障的通透性[16]。本研究顯示治療組與對照組的細胞活力指數(shù)顯著高于LPS組(P<0.05)，細胞凋亡指數(shù)顯著低于LPS組(P<0.05)，治療組與對照組對比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，表明大量過度激活的腸巨噬細胞對腸黏膜屏障是有害的，LP17的應(yīng)用能促進恢復(fù)細胞活力，降低細胞凋亡水平。不過也有研究表明LP17并不能完全阻斷細胞因子的產(chǎn)生，不影響其他免疫系統(tǒng)的能力[17-18]。但大部分研究已經(jīng)證明LP17 是與TREM-1結(jié)構(gòu)相似的合成肽，可競爭性阻斷TREM-1信號，提高膿毒血癥模型小鼠的生存率，一定程度上減少腸巨噬細胞凋亡，降低在炎癥環(huán)境下腸黏膜損害的程度，發(fā)揮腸道保護作用[19]。

腸道巨噬細胞是腸道保護性免疫的重要組成部分，具有維持腸道微生物穩(wěn)定等作用；其在不同的條件下表現(xiàn)出不同的免疫表型，具有分泌、吞噬細胞因子等功能，并能放大炎癥反應(yīng)[20]?；罨蟮木奘杉毎梢院铣煞置诎═NF-α素在內(nèi)的多種細胞因子，并可循環(huán)促進炎癥反應(yīng)的發(fā)生，形成級聯(lián)反應(yīng)[21]。TREM-1為跨膜糖蛋白，由 234 個氨基酸組成，相對分子量為30 KD。TREM-1能進一步增強Toll樣受體所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，同時增加炎性細胞的細胞因子。TREM-1也可識別到不同病原微生物或宿主所產(chǎn)生的危險信號，并引起機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)細胞因子、趨化因子等的產(chǎn)生，在代謝、炎癥、病原體反應(yīng)及組織損傷和修復(fù)中發(fā)揮重要作用，也可進一步清除病原微生物[22]。TREM-1在中性粒細胞表達與膿毒癥的嚴重程度有關(guān)，TREM-1+中性粒細胞計數(shù)分別與SAP大鼠病理評分、血清淀粉酶的水平和促炎性細胞因子的水平正相關(guān)。本研究顯示治療組與對照組的TREM-1、TNF-α相對表達量顯著低于LPS組(P<0.05)，治療組與對照組對比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。相關(guān)研究也表明LP17在大鼠膿毒癥模型可通過阻斷與TREM-1誘餌受體相互作用，可減少炎癥介質(zhì)的釋放，可防止大鼠器官功能衰竭；LP17也能能夠減輕結(jié)腸的炎癥反應(yīng)，從而降低小鼠結(jié)腸炎的嚴重性[23]。

雖然對于TREM-1阻斷可降低炎癥的研究已經(jīng)逐步涉及，但對于TREM-1分子的上下游信號通路及其調(diào)控機制的研究還不夠清楚。TREM-1和TREM 受體表達在各種髓系細胞中，能夠誘導(dǎo)多種炎癥介質(zhì)產(chǎn)生。通過對抗TREM-1抗體在單核細胞上的競爭性抑制，可誘發(fā)細胞內(nèi)鈣離子轉(zhuǎn)移，使促炎性細胞因子及共同刺激因子的產(chǎn)生，放大陽性反應(yīng)[24]。不過TREM-1激活后的信號通路并未完全明確，目前研究表明TREM-1可活化下游信號通路，促進細胞合成促炎因子[25]。因此關(guān)于TREM-1激活在巨噬細胞炎癥中的作用機制還有待進一步研究。

總之，TREM-1特異性拮抗劑LP17能有效提高細胞活力，減少巨噬細胞凋亡，抑制巨噬細胞TREM-1與TNF-α的表達，有望成為治療腸屏障功能障礙的新靶點。