趙夢(mèng)瑤，張文杰，張立攀，王法云，陳儉春

（河南省商業(yè)科學(xué)研究所有限責(zé)任公司，河南鄭州450000）

杜仲（Eucommia ulmoides Oliver）屬杜仲科落葉喬木，又名木棉、思仲。其入藥在中國(guó)有著悠久的歷史，《神農(nóng)本草經(jīng)》、《本草綱目》、《名醫(yī)別錄》中對(duì)其藥用功能都有相應(yīng)的描述。傳統(tǒng)上杜仲樹(shù)皮入藥，由于產(chǎn)量等原因局限性很大。近年來(lái)研究表明杜仲葉藥用成分與杜仲皮基本相同、藥用功能相近，且杜仲葉價(jià)格低廉，產(chǎn)量較高[1]。杜仲葉主要有效成分為綠原酸，是由咖啡酸與奎尼酸組成的縮酚酸，葉中含量可達(dá)1%～5%，十分豐富[2-4]。綠原酸具有降血壓、增高白血球、抗菌、抗病毒和腫瘤、增強(qiáng)免疫力，清除體內(nèi)自由基等功效[5-8]。除了醫(yī)藥領(lǐng)域，綠原酸還可應(yīng)用于食品、日用化工領(lǐng)域[9-10]。對(duì)綠原酸的研究及相關(guān)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)，有著良好的前景[11]。

超聲波技術(shù)對(duì)植物有效成分提取有著提取得率高、提取速度快的優(yōu)點(diǎn)，超聲波本身的破碎作用使樣品顆粒減小，表面積增大；同時(shí)超聲波的空化作用使固液表面的接觸更加充分，增大了接觸面積，從而加快提取速度[12]。本文應(yīng)用超聲波輔助技術(shù)對(duì)杜仲葉中的綠原酸進(jìn)行提取，以綠原酸的得率為考量指標(biāo)，分別進(jìn)行單因素和正交試驗(yàn)，對(duì)從杜仲葉提取綠原酸的工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材料與試劑

杜仲葉：湖南省邵陽(yáng)市；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）：北京索萊寶科技有限公司；無(wú)水乙醇、鹽酸（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.1.2 儀器與設(shè)備

FA2004電子天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；QJ-08B粉碎機(jī)：上海兆申科技有限公司；60目標(biāo)準(zhǔn)型分樣篩：上虞市五四儀器廠；DHG-9052A型臺(tái)式電熱干燥箱：上海捷呈實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；KQ-700DE型超聲波發(fā)生器：上海昆山儀器有限公司；AL204-ICF分析天平：梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易有限公司；RE-2000A快速旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上?？粕齼x器有限公司；UV-8000ST雙光束紫外可見(jiàn)分光：上海元析儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

杜仲葉自然風(fēng)干后，置于電熱干燥烘箱中，于50℃烘6 h，之后再于80℃烘3 h；用粉碎機(jī)將烘干的樣品磨碎后過(guò)60目標(biāo)準(zhǔn)分樣篩，篩過(guò)的葉粉在烘箱中50℃烘3 h。

1.2.2 杜仲葉中綠原酸的超聲波輔助提取工藝

稱取設(shè)定質(zhì)量的杜仲葉粉，加入到設(shè)定濃度和體積的溶劑中，按照設(shè)定的超聲浸提時(shí)間、超聲浸提溫度和超聲浸提次數(shù)進(jìn)行提取。提取物經(jīng)過(guò)濾，少量溶劑潤(rùn)洗濾渣；所有濾液合并，旋干溶劑，用70%乙醇復(fù)溶，并定容至100 mL容量瓶中，為樣品待測(cè)儲(chǔ)備液備用。

1.2.3 綠原酸含量的測(cè)定

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)文獻(xiàn)[3]中方法測(cè)定綠原酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=54.153x-0.005，R2=0.999 8。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

1.2.3.2 綠原酸含量的測(cè)定

統(tǒng)一設(shè)定預(yù)處理杜仲葉粉的秤取重量為1.00 g，以保持樣品待測(cè)儲(chǔ)備液的移取量為1.00 mL，定容至50 mL，按照文獻(xiàn)[3]中的操作方法進(jìn)行測(cè)定。

根據(jù)公式（1）計(jì)算不同試驗(yàn)組杜仲葉提取物綠原酸得率。

圖1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of chlorogenic acid

式中：W為綠原酸得率，%；c為測(cè)定液中綠原酸的濃度，mg/mL；m為稱取的杜仲葉樣品的質(zhì)量，g。

1.2.4 杜仲葉綠原酸超聲波輔助提取單因素試驗(yàn)

1.2.4.1 溶劑pH值的影響

溶劑中乙醇濃度恒定取70%，料液比取1∶20（g/mL），超聲浸提溫度取50℃，超聲浸提時(shí)間取30 min，溶劑pH 值取 3、4、4.5、5、5.5、6 分別進(jìn)行試驗(yàn)。研究超聲溶劑不同pH值與綠原酸提取得率的相互變化關(guān)系與趨勢(shì)。

1.2.4.2 超聲浸提溫度的影響

溶劑中乙醇濃度恒定取70%，溶劑pH值取4.5，超聲浸提時(shí)間取30 min，料液比取 1∶20（g/mL），超聲浸提次數(shù)取1次，超聲浸提溫度分別取30、40、50、60、70℃，進(jìn)行提取試驗(yàn)。研究不同超聲浸提溫度與綠原酸提取得率的相互變化關(guān)系與趨勢(shì)。

1.2.4.3 溶劑中乙醇濃度的影響

取超聲浸提溫度恒定40℃，溶劑pH值取4.5，料液比取1∶20（g/mL），超聲浸提時(shí)間取30 min，超聲浸提次數(shù)取1次，溶劑中乙醇濃度分別取30%、40%、50%、60%、70%和80%，進(jìn)行提取試驗(yàn)。研究不同溶劑中乙醇濃度與綠原酸提取得率的相互變化關(guān)系與趨勢(shì)。

1.2.4.4 超聲浸提時(shí)間的影響

溶劑中乙醇濃度恒定取70%，溶劑pH值取4.5，料液比取1∶20（g/mL），超聲浸提溫度取40℃，超聲浸提次數(shù)取 1 次，超聲浸提時(shí)間分別取 5、10、20、30、40、50、60 min，進(jìn)行提取試驗(yàn)。研究不同超聲浸提時(shí)間與綠原酸提取得率的相互變化關(guān)系與趨勢(shì)。

1.2.4.5 料液比的影響

溶劑中乙醇濃度恒定取70%，溶劑pH值取4.5，超聲浸提時(shí)間取20 min，超聲浸提溫度取40℃，超聲浸提次數(shù)取1次，料液比分別取1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1 ∶30、1 ∶40（g/mL），進(jìn)行提取試驗(yàn)。研究不同料液比與綠原酸提取得率的相互變化關(guān)系與趨勢(shì)。

1.2.4.6 超聲浸提次數(shù)的影響

溶劑中乙醇濃度恒定取70%，溶劑pH值取4.5，料液比取1∶30（g/mL），超聲浸提溫度取40℃，超聲浸提時(shí)間取 20 min，超聲浸提次數(shù)取1、2、3、4、5分別進(jìn)行試驗(yàn)。研究不同超聲浸提次數(shù)與綠原酸提取得率的相互變化關(guān)系與趨勢(shì)。

1.2.5 杜仲葉綠原酸超聲波輔助提取的正交試驗(yàn)

通過(guò)對(duì)單因素試驗(yàn)結(jié)果的分析，得知超聲浸提次數(shù)和超聲料液比對(duì)提取物得率的影響較小，故選擇影響因素較大的溶劑pH值、超聲浸提溫度、溶劑中乙醇濃度和超聲浸提時(shí)間進(jìn)行正交試驗(yàn)。設(shè)計(jì)的因素水平表見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 溶劑pH值的影響

溶劑pH值與杜仲葉綠原酸得率的變化關(guān)系見(jiàn)圖2。

圖2 溶劑pH值與杜仲葉綠原酸得率的變化關(guān)系Fig.2 Effect of pH on the yield of chlorogenic acid from Eucommia ulmoides leaves

根據(jù)圖2可得到，在設(shè)定的溶劑pH值范圍內(nèi)，得率呈現(xiàn)出先增大后降低的趨勢(shì)，且當(dāng)pH值為4.5時(shí)，得率最大。因?yàn)榫G原酸是有機(jī)酸，容易在相對(duì)堿性的環(huán)境下發(fā)生水解，所以在酸性介質(zhì)中較穩(wěn)定，對(duì)綠原酸的提取在微酸性溶劑中更好[13]；但是酸性過(guò)大，其他雜質(zhì)有機(jī)鹽就會(huì)被酸化而溶出，從而影響綠原酸的提取得率。由試驗(yàn)結(jié)果選擇溶劑pH值為4.5左右。

2.1.2 超聲浸提溫度的影響

超聲浸提溫度與杜仲葉綠原酸提取得率的變化關(guān)系見(jiàn)圖3。

圖3 超聲浸提溫度與杜仲葉綠原酸提取得率的變化關(guān)系Fig.3 Effect of extraction temperature on the yield of chlorogenic acid from Eucommia ulmoides leaves

由圖3可知，在設(shè)定的超聲浸提溫度范圍內(nèi)，得率先上升，當(dāng)溫度高于40℃后得率呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)。這是因?yàn)榫G原酸為熱敏性物質(zhì)，溫度過(guò)高可能造成綠原酸分解，同時(shí)也會(huì)使得溶劑中的乙醇揮發(fā)變多，從而降低了得率[14]。故選擇超聲浸提溫度40℃左右。

2.1.3 溶劑中乙醇濃度的影響

溶劑中乙醇濃度與杜仲葉綠原酸提取得率的變化關(guān)系見(jiàn)圖4。

圖4 溶劑中乙醇濃度與杜仲葉綠原酸提取得率的變化關(guān)系Fig.4 Effect of ethanol concentration on the yield of chlorogenic acid from Eucommia ulmoides leaves

由圖4可知，隨著溶劑中乙醇濃度的增加，得率先升高，在乙醇濃度達(dá)到70%時(shí)開(kāi)始下降。這可能是因?yàn)楦哂诖藵舛葧r(shí)，杜仲葉中某些脂溶性物質(zhì)溶出增加，造成提取溶劑的選擇性降低[15]，對(duì)綠原酸的提取造成影響，同時(shí)濃度較大時(shí)，溶劑中乙醇揮發(fā)較快，也會(huì)造成綠原酸的提取得率降低。故選取溶劑中乙醇濃度為70%左右。

2.1.4 超聲浸提時(shí)間的影響

超聲浸提時(shí)間與杜仲葉綠原酸提取得率的變化關(guān)系見(jiàn)圖5。

圖5 超聲浸提時(shí)間與杜仲葉綠原酸提取得率的變化關(guān)系Fig.5 Effect of ultrasonic time on the yield of chlorogenic acid from Eucommia ulmoides leaves

由圖5可知，按照設(shè)定的超聲浸提時(shí)間范圍，提取物得率迅速升高，在達(dá)到20 min以后基本保持穩(wěn)定。這可能是在超聲波作用下，綠原酸在溶劑中達(dá)到了溶解平衡。同時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，溶劑的逸失也會(huì)增加。故選擇超聲浸提時(shí)間20 min左右。

2.1.5 料液比的影響

料液比與杜仲葉綠原酸提取得率的變化關(guān)系見(jiàn)圖6。

圖6 料液比與杜仲葉綠原酸提取得率的變化關(guān)系Fig.6 Effect of solid-liquid ratio on the yield of chlorogenic acid from Eucommia ulmoides leaves

由圖6可知，在設(shè)定的料液比范圍內(nèi)，綠原酸得率隨著溶劑量的增加而逐漸增大，當(dāng)料液比達(dá)到1∶30（g/mL）后，繼續(xù)增加溶劑，綠原酸得率趨于穩(wěn)定并略有下降。增加溶劑，化合物分子傳質(zhì)到溶液中的總量增多，當(dāng)杜仲葉中的綠原酸全被溶出后，繼續(xù)增加溶劑，綠原酸的量不會(huì)再繼續(xù)上升，繼續(xù)增加溶劑量反而使醇溶性蛋白質(zhì)、黏液、樹(shù)脂、鞣質(zhì)、色素、油脂等雜質(zhì)析出量逐漸增加[16]。同時(shí)，料液比太大，會(huì)增加生產(chǎn)成本，給后處理工序增加困難，所以在保證提取效果的同時(shí)，盡量減少溶劑用量[13]。故選擇料液比為1 ∶30（g/mL）左右。

2.1.6 超聲浸提次數(shù)的影響

浸提次數(shù)與杜仲葉綠原酸提取得率的變化關(guān)系見(jiàn)圖7。

圖7 浸提次數(shù)與杜仲葉綠原酸提取得率的變化關(guān)系Fig.7 Effect of extraction times on the yield of chlorogenic acid from Eucommia ulmoides leaves

由圖7可知，當(dāng)浸提次數(shù)為2時(shí)，綠原酸的得率明顯升高，但當(dāng)浸提次數(shù)繼續(xù)增加后，得率基本趨于穩(wěn)定。浸提次數(shù)太多，其他雜質(zhì)的溶出相應(yīng)增加；同時(shí)，會(huì)使生產(chǎn)周期延長(zhǎng)，導(dǎo)致能耗升高，成本增加。故選擇浸提次數(shù)為2。

2.2 杜仲葉綠原酸提取的正交試驗(yàn)

根據(jù)因素水平表，并按照試驗(yàn)中提取的操作步驟進(jìn)行正交試驗(yàn)分析結(jié)果如表2所示。

表2 正交結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test

方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 方差分析Table 3 Variance Analysis of orthogonal test method

根據(jù)表2和表3的結(jié)果，可以得出：對(duì)杜仲葉中提取物綠原酸得率影響，在各個(gè)因素條件中，溶劑pH值和溶劑中乙醇濃度具有顯著性，且溶劑中乙醇濃度的顯著性較大；各因素條件的影響大小依次為：溶劑中乙醇濃度＞溶劑pH值＞超聲浸提溫度＞超聲浸提時(shí)間。說(shuō)明溶劑中乙醇濃度在超聲輔助提取杜仲葉綠原酸的過(guò)程中起著首要作用。正交優(yōu)化后的最優(yōu)提取條件組合為A2B2C3D2，即溶劑中溶劑pH值為4.5，乙醇濃度取70%，超聲浸提溫度取40℃，超聲浸提時(shí)間取25 min，為驗(yàn)證正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)的結(jié)果，在最優(yōu)條件下，5次平行驗(yàn)證試驗(yàn)提取物綠原酸的得率平均值達(dá)到4.06%。

3 結(jié)論

首先設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)，研究了各個(gè)因素條件與提取物綠原酸得率的相互變化關(guān)系與趨勢(shì)；并在此基礎(chǔ)上，通過(guò)正交設(shè)計(jì)優(yōu)化試驗(yàn)得到最優(yōu)工藝為溶劑中溶劑pH值為4.5，乙醇濃度取70%，超聲浸提溫度取40℃，超聲浸提時(shí)間取25 min，在此條件下，綠原酸的得率平均值達(dá)到4.06%。結(jié)果表明采用超聲波輔助技術(shù)對(duì)杜仲葉中綠原酸進(jìn)行提取是可行的，得率較高，這為綠原酸的提取純化工藝提供了參考，也為綠原酸相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)和利用提供了理論依據(jù)。