吳 洋，閆 戈，張慶新，馬曉昱，劉云云，遲 強(qiáng)，陳 瑤

心腦血管病是致殘率和病死率都極高的疾病，抗凝血藥物是抗血栓藥物研制的熱點(diǎn)。抗血栓中成藥因作用全面溫和，不良反應(yīng)低受到人們的關(guān)注［1］。中成藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)多以藥品中某個(gè)或某些成分的含量測(cè)定作為主要檢測(cè)指標(biāo)，但該方法在化學(xué)成分與藥理作用評(píng)價(jià)相關(guān)性方面還存在一定的差距［2］，特別是復(fù)方或含有動(dòng)物藥成分的藥品，很難以某一成分的含量作為評(píng)價(jià)藥品質(zhì)量和藥理作用的標(biāo)準(zhǔn)。復(fù)方蝮蛇膠囊是解放軍第406醫(yī)院研制的純中藥制劑，由地龍、蝮蛇毒、丹參、川芎和當(dāng)歸等多種藥材組成，具有益氣行氣、活血逐瘀的作用，臨床用于治療各種腦血栓中風(fēng)后遺癥之半身不遂、口眼歪斜、手足發(fā)麻、發(fā)涼等癥，取得了良好的治療效果。該制劑建立了薄層色譜鑒別和HPLC法定量測(cè)定阿魏酸含量的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，然而阿魏酸含量的高低卻很難反映與制劑活血化瘀療效的關(guān)系。研究表明抗凝血酶活性與活血化瘀作用具有一定的相關(guān)性［3-5］，如何通過(guò)抗凝作用的定量評(píng)價(jià)提供藥品抗血栓作用的強(qiáng)弱？該研究在前人研究的基礎(chǔ)上，采用抗凝血酶活性為指標(biāo)，對(duì)復(fù)方蝮蛇毒膠囊抗凝血作用的強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定，為復(fù)方中成藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和藥理作用相關(guān)性提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

METTLER AE240電子天平；AS-B超聲波清洗儀；潔凈工作臺(tái)；Thermo移液器；電熱恒溫水浴鍋。凝血酶（批號(hào)223D063，1000U/支，索來(lái)寶生物科技有限公司）；牛纖維蛋白原（批號(hào)601B0210，索來(lái)寶生物科技有限公司）；復(fù)方蝮蛇毒膠囊樣品（解放軍第 406 醫(yī)院，批號(hào) 141018、141019、141020）；氯化鈉注射液（批號(hào)1701110722，辰欣藥業(yè)股份有限公司），三羥甲基氨基甲烷（批號(hào)20180117，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 抗凝血酶的含量測(cè)定［2，6，7］

2.1.1 供試品溶液的制備 取地龍粉末1.08 g，精密稱定，精密加入0.9%氯化鈉溶液5 ml，充分?jǐn)嚢?，浸?0 min，時(shí)時(shí)振搖，離心，4000 rpm/min離心15 min，上清液作為供試品溶液A；取蝮蛇毒末0.0144 g，同法配制供試品溶液B；取地龍粉末1.08 g和蝮蛇毒粉末0.0144 g，同法配制供試液C；取3個(gè)批號(hào)制劑樣品，每個(gè)批號(hào)分別取18粒膠囊內(nèi)容物約 7.2 g（含約地龍 1.08 g，蝮蛇毒 0.0144 g），精密稱定，精密加入0.9%氯化鈉溶液30 ml，同法配制供試品溶液 D1 （批號(hào) 141018），D2 （批號(hào) 141019）和D3（批號(hào)141020）；按照同等比例取無(wú)地龍和蝮蛇毒的中藥材混合物6.1 g，精密稱定，精密加入0.9%氯化鈉溶液30 ml，同法配制供試品溶液E。上述供試液A，D和E分別稀釋20倍，供試液B和C分別稀釋120倍，作為最終相應(yīng)供試品溶液。

2.1.2 陽(yáng)性對(duì)照溶液的制備 取水蛭粉末1 g，精密稱定，同法配制，作為水蛭陽(yáng)性對(duì)照溶液。

2.1.3 陰性對(duì)照溶液的制備 以0.9%氯化鈉溶液作為陰性對(duì)照溶液。

2.1.4 牛纖維蛋白原溶液的制備 精密取牛纖維蛋白原的凝固物適量，加三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液，制成含量為0.5%的溶液（臨用前配制）。

2.1.5 凝血酶溶液的制備 取凝血酶1000 U，加0.9%氯化鈉溶液，制備成1000 U/ml的貯備液，再取適量加0.9%氯化鈉溶液制備成40 U/ml的凝血酶溶液。

2.1.6 測(cè)定方法 精密量取供試品溶液100 μl，置試管（8 mm×38 mm）中，加入含 0.5%（牛）纖維蛋白原溶液 200 μl，搖勻，置水浴中（37±0.5） ℃溫浸5 min，滴加每1 ml中含40單位的凝血酶溶液（每1 min滴加1次，每次1 μl，邊滴加邊輕輕搖勻）至凝固，記錄消耗凝血酶溶液的體積，按下式計(jì)算，結(jié)果見表1。

表1 復(fù)方蝮蛇毒膠囊抗凝血酶活性比較

C1V1式中U——每1 g含凝血酶活性單位，U/g；C1——凝血酶溶液的濃度，μ/ml；C2——供試品溶液的濃度，g/ml；C2V2V1——消耗凝血酶溶液的體積，μl；V2——供試品溶液的加入量，μl；

該結(jié)果顯示，蝮蛇毒為本制劑中抗凝血效果最強(qiáng)的藥物，抗凝血作用>160000 U/g，其次為地龍抗凝血作用>300 U/g，植物藥材混合物也具有一定的抗凝血活性，抗凝血活性接近200 U/g。制劑抗凝血酶活性平均值為333 U/g。

2.2 不同影響因素對(duì)抗凝血酶活性測(cè)定的影響

2.2.1 供試品濃度對(duì)抗凝血酶活性測(cè)定的影響分別取2.1項(xiàng)下未稀釋的供試品溶液，稀釋20倍的供試品溶液和稀釋120倍的供試品溶液進(jìn)行抗凝血酶活性測(cè)定。結(jié)果見表2。

實(shí)驗(yàn)先參照水蛭的抗凝血酶活性實(shí)驗(yàn)進(jìn)行，水蛭可以形成穩(wěn)定的凝固狀態(tài)，而蝮蛇毒原液和蝮蛇毒+地龍樣品無(wú)論怎樣增加凝血酶的體積都無(wú)法形成穩(wěn)定的凝固狀態(tài)，相比較提取體積大的制劑則可以形成半凝固狀態(tài)，進(jìn)一步稀釋后，中藥材、制劑和地龍樣品在稀釋20倍后出現(xiàn)穩(wěn)定的凝固狀態(tài)，而蝮蛇毒單品和蝮蛇毒+地龍樣品只能呈現(xiàn)半凝固狀態(tài)，因此繼續(xù)增加了稀釋倍數(shù)，稀釋至120倍后，呈現(xiàn)穩(wěn)定的凝固狀態(tài)。因此，該實(shí)驗(yàn)不同的樣品最終采用了不同的稀釋倍數(shù)。水蛭為原液，地龍、中藥材和制劑樣品選擇稀釋20倍，蝮蛇毒單品和蝮蛇毒+地龍樣品采用稀釋120倍。

表2 不同稀釋倍數(shù)對(duì)供試品溶液抗凝血酶活性的影響

2.2.2 凝血酶濃度對(duì)抗凝血酶活性測(cè)定的影響凝血酶為逐次滴加，不同濃度凝血酶在滴加后形成的凝膠狀態(tài)不盡相同，濃度為40 U/ml時(shí)凝固速度為2～4 min，濃度為20 U/ml凝固速度變慢，當(dāng)濃度為10 U/ml時(shí)，呈現(xiàn)半凝固狀態(tài)，即使增加凝血酶的體積也不能改變其半凝固狀態(tài)，因此本實(shí)驗(yàn)選擇凝血酶濃度為40 U/ml。

2.2.3 凝血酶滴加體積對(duì)抗凝血酶活性測(cè)定的影響 每次凝血酶滴加的體積影響凝固穩(wěn)定狀態(tài)，當(dāng)每次滴加 2．5 μl和 10 μl時(shí)，極易出現(xiàn)半凝固狀態(tài)，之后即使再滴加凝血酶也不能改變其半凝固狀態(tài)，因此本實(shí)驗(yàn)?zāi)该看蔚渭芋w積為5 μl，凝固狀態(tài)穩(wěn)定。

2.2.4 凝血酶滴加間隔時(shí)間對(duì)抗凝血酶活性測(cè)定的影響 凝血酶不同滴加時(shí)間間隔影響凝固穩(wěn)定狀態(tài)，當(dāng)使用濃度為40 U/ml凝血酶時(shí)，滴加時(shí)間間隔＜2 min時(shí)，可呈現(xiàn)穩(wěn)定的凝固狀態(tài)，隨著時(shí)間間隔的增大反而不能增加凝固狀態(tài)的穩(wěn)定性，呈現(xiàn)半凝固狀態(tài)。因此該實(shí)驗(yàn)?zāi)傅渭娱g隔時(shí)間＜2 min。

3 討論

地龍為《中國(guó)藥典》2015年版收載品種，具有清熱定驚，通絡(luò)，平喘，利尿作用，用于高熱神昏，驚癇抽搐，肢體麻木半身不遂等癥，臨床主要用于腦梗死、高血壓等疾病的治療［6］。研究表明地龍?zhí)崛∫壕哂?抗 凝 、 促 纖 溶 和 改 善 血 液 循 環(huán) 等 作 用［8，9］，1983年，Mihara首次從地龍中提取分離出具有抗凝和溶栓活性的蛋白質(zhì)——蚓激酶，為其抗凝活性物質(zhì)提供了有利的證據(jù)［10］，同時(shí)為含地龍藥品的質(zhì)量評(píng)價(jià)和臨床療效提供了資料。有研究建立復(fù)方地龍膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，將其的抗凝血強(qiáng)度值設(shè)置為不低于12840 U/g［2］。水蛭是《中國(guó)藥典》2015 年版規(guī)定抗凝血活性檢測(cè)的中藥材，其抗凝血值不低于 16．0 U/g［6］，因此該文選擇其作為陽(yáng)性對(duì)照。蝮蛇毒是從蝮蛇毒腺中分泌出來(lái)的一種毒液，含有多種活性酶及蛋白質(zhì)，具有多種生物活性和藥理活性，通常被作為抗栓酶使用［3］。人參再造丸中就含有地龍和原蛇毒［6］，具有活血通絡(luò)，作用，用于氣虛血瘀，風(fēng)痰阻絡(luò)所致的中風(fēng)。1981年國(guó)內(nèi)注射用蝮蛇毒劑應(yīng)用于臨床，但因?yàn)槎拘源蠖Ｖ故褂茫?1］。2009年，由尖吻蝮蛇蛇毒提取物研制的藥物“蘇靈”上市，用于治療各種血管栓塞性疾病及預(yù)防血栓形成［12］。該制劑不僅含有動(dòng)物藥地龍，蝮蛇毒，還有活血化瘀作用的植物藥丹參、川芎等，單采用阿魏酸的含量測(cè)定作為制劑質(zhì)量控制的定量標(biāo)準(zhǔn)，無(wú)法將制劑質(zhì)量與活血化瘀，通絡(luò)養(yǎng)血的作用聯(lián)系起來(lái)。因此，該實(shí)驗(yàn)為復(fù)方蝮蛇毒膠囊抗凝血藥理作用與制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)性提供資料，參照《中國(guó)藥典》2015年版水蛭的抗凝血酶活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)進(jìn)行，分別比較了地龍，蝮蛇毒，地龍+蝮蛇毒，植物藥以及制劑的抗凝活性差異，發(fā)現(xiàn)地龍、蝮蛇毒和制劑的抗凝血活性均顯著高于水蛭，其中以蝮蛇毒抗凝血酶活性最高，超過(guò) 160000 U/g，與報(bào)道蝮蛇毒在小劑量（0．0004～0．036 ku/kg）時(shí)顯示抗凝血活性一致［13］，地龍抗凝血酶活性＞350 U/g。蝮蛇毒與地龍和中藥材混合制成制劑后，其抗凝血酶活性有顯著的降低，原因之一可能是藥物之間的相互作用，降低了其抗凝酶活性；原因之二地龍+蝮蛇毒或者制劑的稱量重量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于蝮蛇毒（1．08∶0．0144 或 7．2∶0．0144），在計(jì)算抗凝血酶活性時(shí)擴(kuò)大了分母數(shù)值，從而使抗凝血酶計(jì)算數(shù)值遠(yuǎn)小于蝮蛇毒單品，但兩者超強(qiáng)的抗凝血活性特別是蝮蛇毒的抗凝活性完全可以從實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象中無(wú)法形成穩(wěn)定的凝固狀態(tài)發(fā)現(xiàn)的。此外，該制劑中含有的中藥材成分也有一定的抗凝效果。研究結(jié)果表明，其抗凝血酶活性較水蛭要強(qiáng)，接近200 U/g，這些植物藥的抗凝血活性與其文獻(xiàn)報(bào)道一致［14］。鑒于制劑中植物藥種類較多而未對(duì)單味藥材進(jìn)行一一比較，植物藥單體成分是否具有抗凝血活性仍有待于進(jìn)一步研究。

測(cè)定抗凝血酶活性時(shí)，供試品的濃度，凝血酶的濃度，每次滴加的體積和時(shí)間間隔都影響最終凝固狀態(tài)的形成。該實(shí)驗(yàn)供試品的稱量以水蛭抗凝血酶實(shí)驗(yàn)取樣量1 g和患者一天最大制劑服用量為基礎(chǔ)（6粒/次，3次/d），在多次凝血酶反應(yīng)陽(yáng)性且狀態(tài)穩(wěn)定的基礎(chǔ)上，最終選擇不同的樣品采用了不同的稀釋倍數(shù)。水蛭為原液，地龍、中藥材和制劑樣品為稀釋20倍，蝮蛇毒單品和蝮蛇毒+地龍樣品稀釋120倍進(jìn)行實(shí)驗(yàn)計(jì)算。在凝血酶選擇40 U/ml，滴加體積為5 μl/次，時(shí)間間隔＜2 min時(shí)，所有樣品均可以呈現(xiàn)穩(wěn)定的凝固狀態(tài)，重復(fù)性好。該實(shí)驗(yàn)表明蝮蛇毒是復(fù)方蝮蛇毒膠囊抗凝血酶活性最強(qiáng)的單味藥，其次為地龍，這兩者在本制劑活血化瘀功效中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，這兩味藥的質(zhì)量是該制劑質(zhì)量的關(guān)鍵。通過(guò)實(shí)驗(yàn)條件摸索和反復(fù)測(cè)試，三個(gè)批號(hào)復(fù)方蝮蛇毒膠囊樣品抗凝血酶活性平均為333 U/g，因此擬將復(fù)方蝮蛇毒膠囊的抗凝血酶活性暫定為≥300.0U/g。

該研究通過(guò)復(fù)方蝮蛇毒膠囊抗凝血酶活性的研究，建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與藥理作用相關(guān)性評(píng)價(jià)，彌補(bǔ)了單純以某味藥物的含量測(cè)定作為藥品質(zhì)量控制方法的不足，更有利于對(duì)藥品質(zhì)量的控制；同時(shí)，該文對(duì)動(dòng)物單味藥的抗凝血酶活性研究也為動(dòng)物藥類質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善提供了資料。