周玉蘭，冀俊林，李玉旺

隨著中國老齡化的加速，癡呆成為老年人致殘的三大因素之一。每年約有10%～15% 的認知障礙患者轉化為癡呆［1］。糖尿病是由胰島素水平不足或胰島素作用缺陷引起的代謝性疾病，糖尿病患者在全球日益增多，2000年糖尿病患者總數(shù)為1．71億人，到 2030 年預計高達 3．66 億人［2］。 糖尿病會導致多系統(tǒng)損害，對認知功能的損害不容忽視［3］。然而，糖尿病相關認知功能損害的機制仍不十分明確，且仍無有效治療。白藜蘆醇是一種天然的酚類化合物，在紅葡萄的表皮中富集，在虎杖中也大量存在。大量研究證實了白藜蘆醇具有許多藥理學作用，包括抗氧化、抗凋亡、抗癌癥及抗炎等特性［4－6］，其對于認知功能同樣具有明顯的改善作用［7］。該實驗采用STZ法建立糖尿病大鼠癡呆模型，通過水迷宮實驗檢測大鼠認知功能的變化來評價白藜蘆醇對糖尿病大鼠認知功能損害的治療效果，并研究其相關機制。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器及主要試劑 MorriS水迷宮（中國醫(yī)學科學院藥物所）；白藜蘆醇（Sigma），TNF－α 及 IL－6 ELISA 試劑盒 （Abcam），β－actin 抗體、Bax、Bcl－2及 Caspase－3抗體（Abcam）。

1.2 實驗動物分組與動物模型的建立 健康成年SD雄性大鼠60只，體重220 g～260 g，購于天津市實驗動物中心，動物質量合格證號：SCXK（京）2005－0001。分為對照組、模型組、治療組，每組20只。所有大鼠進行適應性喂養(yǎng)7 d。模型組和治療組大鼠接受鏈脲佐菌素（STZ）左下腹腹腔注射建立糖尿病模型（鏈脲佐菌素溶于生理鹽水中，按60 mg/kg注射），對照組注射等量生理鹽水。鏈脲佐菌素注射72 h后尾靜脈連續(xù)3 d、每天1次測量血糖（血糖儀測定），若平均血糖＞16．7 mmol/L視為糖尿病模型制作成功。造模后1周，治療組大鼠給予40 mg/kg（10 ml/kg）白藜蘆醇單側腹腔注射治療，1次/d，連續(xù)治療4周。對照組和模型組大鼠每日給予等量生理鹽水腹腔注射。

1.3 行為學檢測大鼠認知功能 白藜蘆醇治療4周后行水迷宮測試檢測各組大鼠空間學習記憶能力。水迷宮水池壁高50 cm，水深40 cm，水溫維持在20～24℃，水池直徑150 cm。在水迷宮的目標象限正中心位置放置一直徑為10 cm的水下隱性平臺，平臺上表面位于水下1 cm處。前5 d進行定位航行實驗，4次/d，每次從不同入水點放入大鼠。每只大鼠面朝水池壁放入池中，記錄逃避潛伏期，即大鼠尋找平臺的時間。若大鼠2 min內未到達水下平臺，則將大鼠小心引導至平臺上，并讓其逗留15 s，120 s則為該大鼠逃避潛伏期時間。第6天撤去水下平臺記錄每組大鼠穿越平臺次數(shù)。

1.4 海馬TNF-α及IL-6檢測 每只大鼠麻醉后提取海馬備用，裂解后勻漿在4℃條件下使用離心機離心 5 min（14 000×g），留取上清液。 利用 ELISA試劑盒測定大鼠海馬中TNF－α和IL－6的濃度。所有的操作步驟按照試劑盒說明書進行。

1.5 海馬Bax、Bcl-2及Caspase-3蛋白檢測 每只大鼠麻醉后提取海馬備用，RIPA進行蛋白裂解（冰上30 min），勻漿在4℃條件下使用離心機離心5 min（14 000×g），隨后測定蛋白濃度（BCA 法）。 取裂解液利用10%SDS聚丙烯酰胺凝膠室溫下電泳（3 h），隨后轉膜，再TTBS處理1 h。再與如下抗體相結合：β－actin 抗體 （濃度 1∶2000）、抗 Bax 抗體（1∶1000）、抗 Bcl－2 抗體（1∶1000）、抗 Caspase－3 抗體（濃度1∶2000），4℃過夜。洗膜，然后利用二抗孵育，室溫下1 h。最后紅外成像系統(tǒng)進行曝光顯影。Bax、Bcl－2、Caspase－3 蛋白與 β－actin 的 IOD 值比值作為其相對蛋白表達量。

1.6 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 17．0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD－t檢驗。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 Morris水迷宮實驗檢測大鼠認知功能 與對照組相比，模型組大鼠逃避潛伏期延長（P＜0．05）；與模型組相比，治療組大鼠逃避潛伏期縮短，長于對照組（P＜0．05）。與對照組相比，模型組大鼠穿越平臺次數(shù)減少（P＜0．05）；與模型組相比，治療組大鼠穿越平臺次數(shù)增加，仍少于對照組（P＜0．05）。結果說明，模型組大鼠認知功能較對照組大鼠下降，白藜蘆醇治療改善了糖尿病大鼠的認知功能，但仍未達到正常水平。治療后大鼠逃避潛伏期與穿越平臺次數(shù)結果見表1。

表1 白藜蘆醇治療對糖尿病大鼠行為學的影響（±s）

表1 白藜蘆醇治療對糖尿病大鼠行為學的影響（±s）

注：與對照組比較，＊P＜0．05；與模型組比較，#P＜0．05。

組別 n 逃避潛伏期（s）穿越平臺次數(shù)對照組 20 21．55±3．33 7．4±2．09模型組 20 52．95±4．86＊ 2．3±0．83＊治療組 20 35．56±4．29＊# 5．4±1．81＊#

2.2 海馬TNF-α及IL-6的表達 模型組大鼠海馬TNF－α及IL－6的含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）；治療組大鼠海馬 TNF－α 及 IL－6 的含量與模型組相比明顯降低，但仍高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。各組大鼠海馬 TNF－α 及IL－6含量見表 2。

表2 各組大鼠海馬部位TNF-α及IL-6的含量（±s）

表2 各組大鼠海馬部位TNF-α及IL-6的含量（±s）

注：與對照組比較，＊P＜0．05；與模型組比較，#P＜0．05。

組別 n TNF－α（ng/ml）IL－6（ng/ml）對照組 5 105．20±12．09 3．27±0．36模型組 5 529．47±38．16＊ 7．84±0．83＊治療組 5 373．81±46．52＊# 5．97±0．85＊#

2.3 Western blot檢測大鼠海馬 Bax、Bcl-2及Caspase-3的表達 利用Western blot方法檢測各組大鼠海馬Bax、Bcl－2及 Caspase－3的表達 （表 3及圖1）。模型組大鼠海馬Bcl－2的表達明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）；治療組大鼠海馬 Bcl－2的表達與模型組相比增多，但仍低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。 模型組大鼠海馬Bax和Caspase－3的蛋白表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）；治療組大鼠海馬 Bax 和 Caspase－3 的蛋白表達與模型組相比降低，但仍高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義 （P＜0．05）。結果提示模型大鼠的Bax和Caspase－3等促凋亡蛋白增高、抗凋亡蛋白Bcl－2減少，說明其海馬凋亡增多；而白藜蘆醇治療可減少糖尿病大鼠海馬凋亡的發(fā)生。

表3 各組大鼠海馬Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白的表達（±s）

表3 各組大鼠海馬Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白的表達（±s）

注：與對照組相比，＊P＜0．05；與模型組相比，#P＜0．05。

組別 n對照組 5模型組 5治療組 5 Bcl－2 Bax Caspase－3 0．74±0．18 0．16±0．02 0．07±0．01 0．29±0．07＊ 0．60±0．08＊ 0．38±0．09＊0．54±0．12＊# 0．42±0．06＊# 0．24±0．06＊#

圖1 各組大鼠凋亡相關蛋白表達

3 討論

糖尿病是認知障礙及癡呆的危險因素之一。據(jù)報道，糖尿病患者的癡呆發(fā)病率總體上超過50%［8］。與非糖尿病患者相比，患者會伴隨明顯的認知下降［9］。嚙齒動物的糖尿病模型同樣表現(xiàn)出了認知功能的受損，利用鏈脲佐菌素（STZ）誘導的糖尿病大鼠顯示了學習能力下降［10］。然而，對于認知障礙的治療尚無有效措施。糖尿病是社會公共衛(wèi)生的一個嚴峻問題，各種降糖藥或胰島素會引起許多不良反應，并面臨胰島素抵抗或低血糖癥等重大挑戰(zhàn)。最近的趨勢是使用天然藥物治療糖尿病及其并發(fā)癥，它可以產(chǎn)生同樣的功效而不會產(chǎn)生很多不良反應［11］。白藜蘆醇是一種天然存在的多酚類物質，在許多可食用植物的表皮中存在，白藜蘆醇的有益作用是通過多種途徑來實現(xiàn)的，這些途徑包括控制炎癥、抗氧化應激、保護線粒體功能和抑制細胞凋亡等［12－14］。白藜蘆醇已被證實能改善各種類型急性中樞神經(jīng)損傷的組織病理學和行為結果，包括中風，創(chuàng)傷性腦損傷，蛛網(wǎng)膜下腔出血和脊髓損傷等［15－17］。該實驗發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠的認知功能出現(xiàn)了明顯的下降，經(jīng)過4周的白藜蘆醇治療后，糖尿病大鼠的認知功能得到了明顯的改善。

炎癥反應是一種生理調節(jié)，它可以調節(jié)糖尿病患者的神經(jīng)可塑性和神經(jīng)發(fā)生，卻不依賴于高血糖或皮質酮的分泌情況［18］。大量研究證實促炎因子的升高與糖尿病密切相關［19］。糖尿病會增加人類和動物的炎癥反應，通過促進炎癥因子的釋放從而導致海馬產(chǎn)生抗神經(jīng)發(fā)生作用［20］。腫瘤壞死因子（TNF－α）是一種促炎性細胞因子，主要由激活的吞噬細胞，T淋巴細胞和肥大細胞產(chǎn)生［21］。 TNF－α是在激活宿主先天防御時首先產(chǎn)生的促炎細胞因子，上皮和內皮細胞是其主要靶點［22，23］。 TNF－α 對目標細胞產(chǎn)生多重影響，包括刺激這些細胞產(chǎn)生和釋放多種炎性細胞因子［24］。IL－6是一種多功能的細胞因子，與宿主的先天防御和炎癥反應密切相關，在多種炎癥條件下，IL－6 的含量均會增加［25］。 TNF－α 及 IL－6等促炎因子被認為與糖尿病大鼠的認知功能障礙密切相關，減少TNF－α及IL－6的表達可有效改善糖尿病大鼠的認知功能［26］。該實驗觀察到糖尿病大鼠海馬TNF－α及IL－6的表達增多，治療組大鼠海馬TNF-α及IL-6的表達減少，提示白藜蘆醇對于糖尿病大鼠具有明顯的抗炎特性，這可能是白藜蘆醇改善糖尿病大鼠認知功能的重要作用機制之一。

凋亡是一種程序性的細胞死亡方式，在細胞死亡的眾多不同機制中，細胞凋亡被提出用以解釋許多神經(jīng)障礙中所觀察到的細胞缺失，如阿爾茨海默病、血管性癡呆、帕金森病、肌萎縮側索硬化、卒中等［27］。Bcl-2和Bax是負責調控細胞凋亡的兩個主要基因。Bcl-2是抗凋亡家族的關鍵成員，它對調節(jié)線粒體介導的細胞凋亡至關重要［28，29］。 Bcl-2 的過度表達已經(jīng)被證明可以保護神經(jīng)細胞免受神經(jīng)毒素的傷害［30］。Bax屬于促凋亡子家族中的一員，它通過轉移到線粒體膜上，促進細胞色素C的釋放，從而促進下游的細胞凋亡過程［31］。Caspase屬于半胱氨酸蛋白酶家族，是細胞凋亡的重要介質。Caspase參與凋亡過程主要通過兩種不同的途徑：死亡受體途徑和線粒體途徑［32］。無論涉及什么途徑，Caspase-3都扮演著凋亡執(zhí)行者的作用。Caspase-3是一種促凋亡酶［33，34］，通過激活 DNA 分裂因子，進而激活內切酶分裂核DNA，最終導致細胞凋亡。Zhao等［35］研究發(fā)現(xiàn)糖尿病增加Bax和Caspas-3的表達，從而進一步導致了STZ誘導的糖尿病大鼠的錐體神經(jīng)元細胞凋亡。高血糖使海馬神經(jīng)元細胞中活性氧升高，導致ATP的活性降低，使Caspases-3和Caspases-9表達增加，從而產(chǎn)生Caspase依賴性的細胞凋亡發(fā)生［36］。該實驗觀察到糖尿病大鼠海馬Caspase-3和Bax的表達增多，而Bcl-2降低，說明糖尿病大鼠出現(xiàn)了海馬凋亡途徑的激活。治療組大鼠海馬Caspase-3和 Bax的表達減少，Bcl-2的表達增多，提示白藜蘆醇治療對于糖尿病大鼠具有明顯的抗凋亡特性。

綜上所述，白藜蘆醇治療可明顯改善糖尿病大鼠認知功能的損傷，降低促炎因子子TNF-α及IL-6的表達，抑制了凋亡相關蛋白的表達，其對糖尿病大鼠認知功能的改善作用機制可能與抑制凋亡途徑和抗炎作用密切相關。為臨床糖尿病相關認知功能障礙和其他類型癡呆的有效治療提供了更多的理論支持。