張偉浩 柳賢德 樸伶華

摘要：將轉基因斑馬魚Tg（CYP1A：GFP）和Tg（Flk1：EGFP）暴露于不同濃度的3種抗生素（鹽酸慶大霉素、硫酸硫酸卡那霉素、鹽酸萬古霉素）中24 h，觀察其熒光變化。結果表明，以ABIX野生型斑馬魚胚胎進行毒性試驗，藥物暴露24 h后鹽酸慶大霉素、硫酸卡那霉素和鹽酸萬古霉素的最高合理濃度分別為120、150、240 μg/mL。3種抗生素對CYP1A轉基因斑馬魚幼魚藥物暴露24 h后，鹽酸慶大霉素、硫酸卡那霉素和鹽酸萬古霉素分別在2、4、0.4 μg/mL時開始出現(xiàn)熒光。而與對照（0 μg/mL鹽酸萬古霉素）相比，F(xiàn)lk1轉基因斑馬魚胚胎只有當240 μg/mL鹽酸萬古霉素的高濃度暴露下才會出現(xiàn)血管被顯著抑制的效果（P<0.05）。綜上所述，F(xiàn)lk1對這3種藥物的敏感度過低，不適合用于這3種抗生素污染的檢測，而CYP1A轉基因斑馬魚幼魚對這3種抗生素的敏感度都很高，可以作為這些抗生素污染的生物監(jiān)測手段，這進一步開發(fā)了轉基因斑馬魚在水環(huán)境檢測氨基糖苷類和糖肽類抗生素污染中的應用。

關鍵詞：抗生素;轉基因斑馬魚;水質檢測

中圖分類號： X832 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）22-0269-04

近年來，在全球各地自然環(huán)境中頻繁檢測到抗生素，這些抗生素大多數(shù)為人用非處方藥、獸用抗生素和飼料添加劑，其使用量大，持續(xù)時間持久，在環(huán)境中廣泛存在，對于非靶標生物特別是水生生物的毒性作用逐漸受到重視。以我國為例，2013年全國36種常用抗生素總消耗量約為92 700 t，其中 54 000 t 抗生素經由人和動物排泄到體外，經過各種污水處理系統(tǒng)，最終53 800 t抗生素進入自然環(huán)境中[1]。畜牧業(yè)使用的抗生素絕大多數(shù)以原藥被牲畜排泄物帶進土壤后滲入地下水形成污染;水產養(yǎng)殖中使用的抗生素則有70%～80%最終會進入水環(huán)境[2]。目前使用較多的抗生素的種類主要有：β-內酰胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、氯霉素類、大環(huán)內酯類、糖肽類抗生素、喹諾酮類等。

斑馬魚（zebrafish，Danio rario）具有個體小、發(fā)育周期短、養(yǎng)殖費用低、體外受精、透明、單次產卵數(shù)較高以及對污染物的反應快速等優(yōu)點。更重要的是，斑馬魚的基因與人類基因相似度高達87%，并擁有與人相似的組織器官和系統(tǒng)，被國際標準化組織（International Organization for Standardization，ISO）和經濟合作與發(fā)展組織（Organization for Economic Co-operation and Development，OECD）認定為標準魚類毒性測試生物。水體受到污染物侵入后，魚的生存環(huán)境發(fā)生轉變，污染物通過魚類鰓呼吸運動、吞食和魚體表面滲入進入體內，繼而魚類的生理活動隨著水體環(huán)境的污染程度做出反應[3-4]。其行為變化遵循環(huán)境壓力模型，即隨時間經歷穩(wěn)定、急劇變化、恢復、逐漸消失過程，行為強度會隨污染物濃度和時間而變化[5-6]。相比于斑馬魚成魚，早期生命階段的斑馬魚胚胎因其快速、敏感、高通量和體外測試等優(yōu)點被逐漸用于環(huán)境監(jiān)測領域，成為環(huán)境監(jiān)測的“哨兵”和“指示兵”[7]。

鹽酸慶大霉素和硫酸卡那霉素同屬氨基糖苷類化合物，作為廉價的廣譜性抗菌素，在規(guī)?；B(yǎng)殖中使用廣泛，近年來也有鹽酸慶大霉素對雞瘟治理效果很好的相關報道[8]。我國是氨基糖苷類抗生素的主要生產國，至2010年，鹽酸慶大霉素產量突破2 500 t，其他如硫酸卡那霉素、奈替米星等的產量合計近1 000 t[9]。氨基糖苷類抗生素脂溶性差，因此人體和畜禽的胃腸道幾乎不吸收，肌肉注射后大部分以原藥經腎排泄[10]，因此在食物鏈中的富集情況非常嚴重。有研究認為氨基糖苷類抗性基因是在污水、廢水和動物糞便中最頻繁檢出的一類抗性基因[11]，在天然水體中也有檢出[12]，并且很多氨基糖苷類抗性基因與可移動遺傳元件有關。然而氨基糖苷類抗生素及其抗性基因對環(huán)境影響的相關研究并不多。鹽酸萬古霉素屬于糖肽類抗生素，其作用機制主要是通過阻礙細菌細胞壁的合成導致致病菌死亡，臨床上主要用于治療嚴重革蘭氏陽性菌感染，尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）感染[13]。因對革蘭氏陽性菌有很強的抗菌效果，所以廣泛用于家禽、家畜等飼料添加劑和獸藥[14]。但這種藥物的濫用導致耐藥菌快速產生。據(jù)報道，2003年出現(xiàn)了大量耐鹽酸萬古霉素細菌[15]。因此，我國農業(yè)農村部規(guī)定將鹽酸萬古霉素列為禁用獸藥。本試驗選用這3種使用比較普遍的抗生素為對象，用生物監(jiān)測手段觀察轉基因斑馬魚對不同濃度抗生素的反應，以期開發(fā)斑馬魚對于水質快速檢測的潛力，使水質抗生素檢測更經濟快捷。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗藥品：鹽酸慶大霉素、硫酸卡那霉素、鹽酸萬古霉素（Biotopped，北京）。斑馬魚：ABIX野生型、Tg（CYP1A：GFP）和Tg（Flk1：EGFP）轉基因型品系購自國家斑馬魚資源中心（CZRC）。儀器設備：斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)（愛生科技發(fā)展有限公司，北京）;BPC-250 F型生化培養(yǎng)箱（一恒科學儀器有限公司，上海）;X71熒光顯微鏡（奧林巴斯公司，日本）;一次性吸管、培養(yǎng)皿、塑料六孔細胞培養(yǎng)板（TrueLine，美國）;三卡因甲磺酸鹽麻醉劑（簡稱TMS，CAS編號：886-86-2，Sigma-Aldrich公司，美國）;氯化鈉、碳酸氫鈉等化學藥品均為分析純，購自西隴科學股份有限公司;Heal Force超純水系統(tǒng)（力康集團，香港）。

1.2 3種抗生素的毒性試驗

斑馬魚胚胎毒性試驗：為保證對照組胚胎死亡率小于5%，排除未受精及異常胚胎對毒性評價的干擾，本試驗選擇在受精后48 h（48 hpf）開始暴露藥物。收集到胚胎6 h后，去除異常和死胚，最后挑選出發(fā)育正常的胚胎。試驗濃度范圍根據(jù)預試驗結果設置，將提前配制的高濃度儲備液用藍水稀釋到不同梯度，包含1個對照組，5個處理組。每個處理組包含3個生物學重復，20個胚胎為1個重復。試驗在6孔板中進行，每孔加入20個健康胚胎，盡量去除水分之后再分別加入不同濃度的處理液5 mL，對照組加入等體積藍水。采用半靜態(tài)方式進行暴露處理，將培養(yǎng)皿置于恒溫生化培養(yǎng)箱中，暴露總時間為96 h（即從48 hpf～144 hpf），培養(yǎng)箱孵化溫度為（28±0.5） ℃，處理液pH值維持在7，電導率約510 μS/cm，溶氧量>6 mg/L，胚胎保持光 —暗周期為14 h—10 h。毒性試驗對斑馬魚胚胎每24 h更換1次處理液，及時挑出死亡的胚胎。每24 h對斑馬魚胚胎進行1次鏡檢觀察，計量不同時期的各項生理指標和死亡、畸形等數(shù)據(jù)，進行記錄。

1.3 抗生素對血管發(fā)育的影響

3種抗生素的不同濃度對48 hpf的Flk1斑馬魚胚胎暴露24 h，然后用熒光顯微鏡觀察節(jié)間血管的直徑。

1.4 抗生素對CYP1A蛋白表達的影響

在對CYP1A和Flk1的試驗中，斑馬魚胚胎于48 h用滅過菌的鑷子顯微鏡下手動破膜，并挑選出正常發(fā)育的幼魚。3種抗生素的不同濃度對48 hpf的CYP1A斑馬魚胚胎暴露 24 h，然后用熒光顯微鏡觀察熒光強度。

1.5 試驗時間及地點

試驗于2017年5月至2018年2月，在海南大學熱帶作物種質資源保護與開發(fā)利用教育部重點實驗室進行。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

CYP1A斑馬魚胚胎觀察其頭部熒光強度，用軟件Image J反轉成灰度值分析出其熒光強度，最終以熒光強度值相互比較;Flk1斑馬魚胚胎觀察其血管發(fā)育情況，選取中間部位的節(jié)間血管用Image-Pro plus分析出血管的直徑，試驗每組每個濃度胚胎數(shù)量至少20個。所有數(shù)據(jù)用SPSS分析，graphpad作圖。

2 結果與分析

2.1 斑馬魚胚胎毒性試驗

2.1.1 鹽酸鹽酸慶大霉素對胚胎死亡率的影響 根據(jù)預試驗結果，藥物暴露96 h后，900 μg/mL濃度組幼魚全部死亡，所以筆者選用900 μg/mL為鹽酸慶大霉素的最高濃度。如圖1-A，藥物暴露24 h后鹽酸慶大霉素的毒性開始顯露，當鹽酸慶大霉素為180 μg/mL時胚胎開始出現(xiàn)極少數(shù)死亡，死亡率只有2.5%。

2.1.2 硫酸硫酸卡那霉素對胚胎死亡率的影響 預試驗結果表明，藥物暴露96 h后，1 000 μg/mL濃度組幼魚全部死亡，藥物暴露24 h后從200 μg/mL開始出現(xiàn)死亡（圖1-B）。

2.1.3 鹽酸萬古霉素對胚胎死亡率的影響 鹽酸萬古霉素不同濃度暴露96 h后，筆者發(fā)現(xiàn)當鹽酸萬古霉素濃度為 1 200 μg/mL 時幼魚全部死亡，因此將1 000 μg/mL設為處理的最高濃度。藥物暴露24 h后當鹽酸萬古霉素濃度為 300 μg/mL 時胚胎開始出現(xiàn)死亡，表明鹽酸萬古霉素的毒性發(fā)生點在200 μg/mL濃度持續(xù)處理24 h處（圖1-C）。

2.2 抗生素對血管發(fā)育的影響

根據(jù)抗生素對胚胎處理24 h毒性的影響（圖1），鹽酸慶大霉素選用40、80、120 μg/mL濃度處理Flk1幼魚;硫酸卡那霉素選用50、100、150 μg/mL濃度處理Flk1幼魚;鹽酸萬古霉素選用80、160、240 μg/mL濃度處理幼魚。鹽酸慶大霉素和硫酸卡那霉素處理組的節(jié)間血管發(fā)育與對照（0 μg/mL）相比無顯著差異，當鹽酸萬古霉素濃度為240 μg/mL處理時胚胎血管直徑與對照出現(xiàn)顯著差異（P<0.05）（圖2、圖3），節(jié)間血管的直徑減少至2 μm以下。

2.3 抗生素對CYP1A蛋白表達的影響

預試驗表明，隨著藥物處理時間的延長，幼魚最先出現(xiàn)綠色熒光的是腦部。由圖4可知，藥物暴露24 h后，這3種抗生素低濃度時可以促進CYP1A蛋白質的表達，并有濃度依賴性。由圖4、圖5可知，2 μg/mL鹽酸慶大霉素處理組開始出現(xiàn)熒光，隨著濃度增加各組間熒光強度逐漸增強并具有顯著差異（P<0.05）;4 μg/mL硫酸卡那霉素處理組開始出現(xiàn)熒光，6 μg/mL處理組的熒光強度是4 μg/mL組的4倍，各組與對照組均具有顯著差異（P<0.05）;其中，CYP1A蛋白對鹽酸萬古霉素的敏感性比鹽酸慶大霉素和硫酸卡那霉素更強，在0.4 μg/mL處理組就開始出現(xiàn)熒光，相比于氨基糖苷類的鹽酸慶大霉素和硫酸卡那霉素更敏感。

3 討論

氨基糖苷類抗生素具有較強的腎毒性和耳毒性[16]，其濫用濫排現(xiàn)象已對人類和動物的生存環(huán)境構成威脅。鹽酸萬古霉素屬糖肽類抗生素，起初因良好的耐藥菌治療效果在畜牧行業(yè)大量使用，因其濫用造成耐鹽酸萬古霉素菌快速形成。這些表明，環(huán)境中抗生素的污染不容小覷，因此，抗生素的早期檢測是非常重要的。筆者希望轉基因斑馬魚在作為現(xiàn)代醫(yī)學模式動物“寵兒”的同時，也能在水環(huán)境監(jiān)測中起到作用。

Flk1（EGFP）斑馬魚是針對血管發(fā)綠色熒光的轉基因斑馬魚，Cross等運用G-RCFP標記插到VEGF2基因的啟動子序列表達，從而得到了有綠色熒光血管的轉基因斑馬魚，能很清楚地觀察到血管的狀態(tài)[17]。利用血管的可視化，可以快速準確地看出藥物對血管的作用，本試驗結果表明，鹽酸慶大霉素和硫酸卡那霉素在一定濃度下對血管發(fā)育沒有明顯影響，而鹽酸萬古霉素在較高濃度時才有抑制血管生成的作用，這說明Flk1轉基因斑馬魚不適用于這3種抗生素的快速檢測。

CYP1A屬于細胞色素P450超家族，廣泛分布于腦、肝及其他很多部位中，參與烴類致癌物的代謝，CYP1A2在肝組織中有特異性表達，參與許多前致癌物和前毒物的代謝活化[18]。CYP1A轉基因斑馬魚目前在水質檢測方面較多應用于多環(huán)芳香烴類化合物的檢測[19]，很少用于其他污染物的檢測。Ohlsen等檢測醫(yī)院廢水中的抗生素濃度，其中鹽酸慶大霉素的濃度不低于0.01 mg/L[20]。本試驗數(shù)據(jù)表明，鹽酸慶大霉素和硫酸硫酸卡那霉素濃度分別為2 μg/mL和4 μg/mL時，CYP1A斑馬魚頭部開始出現(xiàn)熒光。鹽酸萬古霉素濃度為0.4 μg/mL時，幼魚頭部開始出現(xiàn)熒光，這表明CYP1A對鹽酸萬古霉素更敏感。所以CYP1A具有作為氨基糖苷類化合物生物監(jiān)測手段的潛力。

4 結論

隨著基因工程技術的發(fā)展，轉基因斑馬魚技術也越來越成熟。本試驗得出，CYP1A斑馬魚在用于檢測鹵化芳香族碳氫化合物的同時，也可以作為其他部分化合物的生物標記。Flk1斑馬魚對這3種抗生素的敏感程度太低，所以不適合作為這3種抗生素的檢測手段。這說明一種轉基因斑馬魚在用于醫(yī)學定向研究的同時可能還具有用于檢測水體中化合物污染的作用，這進一步擴展了轉基因斑馬魚的用途，為水體環(huán)境污染的快速監(jiān)測提供了更經濟方便的手段。

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