許彥明 張震 陳永忠

摘要：以不同樹齡油茶的葉片為試驗材料，研究不同樹齡油茶葉片的葉綠素含量、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量及抗氧化酶活性的變化狀況，分析葉片生理指標隨樹齡的變化規(guī)律。結(jié)果表明，在不同樹齡的油茶樹中，二年生葉片的葉綠素a（Chl a）、葉綠素b（Chl b）和Chl a+Chl b含量均顯著高于一年生葉片;古樹二年生葉片的Chl a、Chl b、Chl a+Chl b含量最高，分別為1.57、0.12、1.69 mg/g;在不同樹齡的油茶樹中，二年生葉片中丙二醛（MDA）和過氧化氫（H2O2）含量均高于一年生葉片中的含量;在古樹中，一年生葉片中的MDA和H2O2含量分別為13.61 nmol/g、131.06 μg/g，均高于壯齡樹和幼樹;在古樹中，一年生葉片中的脯氨酸含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量均偏高，部分滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)隨樹齡越低而逐漸減少，且低于二年生葉片中的含量;在壯齡樹中，二年生葉片中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）活性均高于一年生葉片，且古樹葉片中的SOD、POD和CAT活性均明顯強于壯齡樹和幼樹。油茶古樹有較高的酶活性，能有效清除植物衰老過程中自身代謝所產(chǎn)生的活性氧（ROS）等物質(zhì)，使古樹依然保持著正常的生理代謝活動。

關(guān)鍵詞：油茶古樹;抗衰老;葉片;葉綠素含量;生理特性

中圖分類號： S794.401 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）22-0188-03

植物衰老指植物的某個器官或整個植株生命功能的衰退并最終導致其自然死亡的一系列變化過程，是植物生長發(fā)育周期中一個重要的生理現(xiàn)象[1]。植物衰老過程受到多種因素的影響，生物因素包括植物競爭關(guān)系、自身基因等[2]，非生物因素主要包括不良外界環(huán)境導致的干旱、鹽堿、高溫、低溫以及重金屬等脅迫逆境[3-4]。葉片是植物重要的生長器官，植物衰老的主要外部特征表現(xiàn)是生長速率下降、葉片變黃、脫落，生理特性表現(xiàn)是葉片中氮（N）、磷（P）、鉀（K）、銅（Cu）等含量降低，鈣（Ca）、鎂（Mg）等含量增加[5]。在生命周期的不同階段，隨著年齡的增加，植物生長速率降低，抗逆性能力下降，光合作用減弱，細胞內(nèi)一系列抗氧化酶表現(xiàn)出動態(tài)變化。對古樹而言，在細胞器中發(fā)生的漸進性功能衰退及細微的結(jié)構(gòu)變化，都會直接影響古樹的代謝平衡，干擾古樹的正常生長，其中葉片的衰老是程序性細胞死亡的特殊退化過程[6]。植物葉片中葉綠素含量的高低和降解的速率可作為衡量植物衰老與否和衰老快慢的重要標志[7];同樣，隨著葉片中磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）羧化酶活性的降低，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）等保護酶活性的降低以及可溶性蛋白含量、可溶性糖含量等部分滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)濃度的降低，作為植物衰老指標的丙二醛（MDA）含量會增加，進而加速其衰老進程。

目前，國內(nèi)外關(guān)于植物衰老的生理特性研究很多，并取得了一些成果。孫艷等發(fā)現(xiàn)，MDA含量、相對電導率（REC）及POD活性隨黃瓜葉片逐漸衰老而顯著升高，光合色素含量、可溶性蛋白質(zhì)含量、SOD與CAT活性顯著降低[8]。在古油松衰弱衰老樹中，針葉長度、葉綠素含量、MDA含量及SOD活性等生理指標均不及幼樹[9]。朱利君等對珙桐葉的研究發(fā)現(xiàn)，珙桐葉POD活性和MDA含量對生長期敏感，同樹齡同葉位的珙桐葉隨葉片的生長和衰老，POD活性和MDA含量逐漸升高，且不同樹齡、葉位、層次的POD活性和MDA含量存在差異[10]。薛秋華等發(fā)現(xiàn)，古槐葉片中N、P、Mg元素含量低于幼槐，Ca、鐵（Fe）、錳（Mn）含量則高于幼槐，K元素含量在古槐和幼槐葉片中基本相同[11]。

關(guān)于植物衰老指標的研究有很多[12-14]，這些研究能夠從生理特性方面揭示植物衰老進程，為古樹復壯、更新、瀕危樹種的保護等研究提供一定的參考。油茶作為我國特有的木本油料樹種，生命周期長達數(shù)百年。目前，關(guān)于油茶的研究主要集中在高效栽培[15-16]、育種[17-18]、繁育及加工利用[19]等方面，關(guān)于油茶古樹衰老中光合色素、酶活性等生理特性的研究相對較少。本研究通過測定不同樹齡油茶葉片的相關(guān)生理指標，如葉綠素、抗氧化系統(tǒng)酶、部分滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)等，比較不同樹齡油茶的葉片生理生化指標與樹齡之間的差異，以期明確油茶古樹抗衰老的生理特性，為油茶古樹的樹勢評價、日常養(yǎng)護管理以及復壯、保護等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況

研究地位于湖南省林業(yè)科學院試驗林場（113°01′30″E，28°06′40″N）。該區(qū)域?qū)賮啛釒Ъ撅L濕潤氣候，年平均氣溫17.5 ℃，年日照時數(shù)為1 841.8 h，年平均降水量為 1 378 mm，年平均相對濕度為81%;土壤系第四紀紅色黏土網(wǎng)紋層母質(zhì)發(fā)育的酸性紅壤，pH值在4.5～5.5之間。

1.2 供試材料

于2017年6月中旬，選擇生長健壯、長勢良好的油茶幼樹（6年）、壯齡樹（30年）、古樹（>100年）的優(yōu)良單株進行采樣。在6月下旬，分別采取每個單株樹冠外圍中上部受光相對一致、健壯、無病變損傷的一年生和二年生功能葉片作為試驗材料（3個生物學重復）。采集的葉片裝入塑封袋并編號，迅速放入冰盒并帶回實驗室，用去離子水擦洗干凈后，置于-70 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 指標測定方法

葉綠素含量的測定采用丙酮浸提法;超氧化物酶活性的測定采用核黃素-氮藍四唑（NBT）光還原法;過氧化物酶活性的測定采用愈創(chuàng)木酚法;過氧化氫酶活性的測定采用高錳酸鉀滴定法;脯氨酸含量的測定采用茚三酮顯色法;可溶性糖含量的測定采用比色法;可溶性蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍G-250染色法;丙二醛含量的測定采用硫代巴比妥酸法;過氧化氫含量的測定采用三氯乙酸比色法。葉片相關(guān)生理生化指標的測定均重復3次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2003對原始數(shù)據(jù)進行整理、作圖，用SPSS 16.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計與方差分析。同一樹齡不同年齡葉片的生理指標差異顯著性采用成對t檢驗法，不同樹齡同一年齡葉片的生理指標差異顯著性采用單因素方差分析，多重比較采用最小顯著差異法。

2 結(jié)果與分析

2.1 油茶葉片中葉綠素含量的變化

不同樹齡油茶葉片的葉綠素含量存在明顯差異（表1）。從樹齡看，除幼樹Chla含量外，3種樹齡油茶的二年生葉片Chl a、Chl b和Chl a+Chl b的含量均顯著高于一年生的葉片。其中，油茶古樹的二年生葉片Chl a、Chl b和Chl a+Chl b 的含量分別為1.57、0.12、1.69 mg/g，分別比一年生葉片高0.45、0.03、0.48 mg/g。

3種樹齡油茶的一年生油茶葉片中，葉綠素含量隨樹齡的增加均呈現(xiàn)先降后增的趨勢。古樹葉片的Chl a、Chl a+Chl b含量最高，分別為1.12、1.21 mg/g，其次為幼樹和壯齡樹。而在二年生油茶葉片中，葉綠素含量隨樹齡的增加而升高，古樹的Chl a、Chl b、Chl a+Chl b含量均顯著高于壯齡樹和幼樹，分別是幼樹的1.78、1.09、1.71倍。

2.2 油茶葉片中MDA、H2O2含量的變化

3種樹齡油茶的二年生葉片的MDA和H2O2含量均顯著高于一年生葉片的含量;其中，古樹的二年生葉片中MDA含量最高，為22.88 nmol/g，是一年生葉片含量的 1.68 倍;壯齡樹二年生葉片中H2O2含量最高，為416.26 μg/g（表2）。

3種樹齡油茶的一年生油茶葉片中MDA和H2O2含量變化趨勢一樣，均隨樹齡的增長而增加;古樹葉片中MDA和H2O2含量最高，分別為13.61 nmol/g、131.06 μg/g，其次為壯齡樹，分別為12.77 nmol/g、118.07 μg/g，幼樹葉片中的MDA和H2O2含量最低，分別為7.83 nmol/g、110.04 μg/g。在二年生葉片中，古樹葉片中的MDA含量最高，為22.88 nmol/g，壯齡樹葉片中H2O2含量最高，為416.26 μg/g。

2.3 油茶葉片中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的變化

古樹一年生葉片中3種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量均高于二年生葉片中的含量（表3），分別為8.58 μg/g、23.83 mg/g、17.15 mg/g。壯齡樹一年生葉片中脯氨酸和可溶性蛋白含量高于二年生葉片，可溶性糖含量顯著低于二年生葉片。而幼樹一年生葉片僅有可溶性蛋白含量顯著高于二年生葉片，為27.24 mg/g。

隨著油茶樹樹齡的增加，一年生葉片中的脯氨酸和可溶性糖含量逐漸增加，在古樹葉片中的含量最高，分別是幼樹葉片中含量的6.70、1.15倍，而可溶性蛋白含量在古樹中遠低于壯齡樹和幼樹，僅為17.15 mg/g。二年生葉片中的脯氨酸含量變化趨勢不同于一年生，古樹葉片中脯氨酸含量最高，為8.58 μg/g，而可溶性糖和可溶性蛋白的最大含量分別出現(xiàn)在幼樹和壯齡樹，分別為30.63、25.90 mg/g。

2.4 油茶葉片中SOD、POD和CAT活性的變化

在3種樹齡油茶中，二年生葉片中SOD活性顯著高于一年生葉片中酶活性，尤以古樹葉片中SOD活性最高，為898.37 U/g;雖然二年生葉片POD活性在壯齡樹和幼樹中略高于一年生葉片，但3種樹齡不同年齡葉片中POD活性之間差異不顯著;除幼樹葉片中CAT活性以外，其他樹齡不同年齡葉片中CAT活性差異不顯著（表4）。

3種樹齡油茶的一年生油茶葉片中，古樹葉片中SOD活性為372.52 U/g，顯著低于壯齡樹和幼樹，而POD和CAT的活性顯著高于壯齡樹和幼樹，分別為34.68、585.91 U/（g·min）。二年生葉片中，古樹葉片中SOD、POD、CAT酶活性最高，分別為 898.37 U/g、25.31 U/（g·min）、487.64 μg/（g·min），其次是壯齡樹葉片中的酶活性，幼樹葉片中的酶活性最低（表4）。

3 結(jié)論與討論

葉綠素是植物進行高效光合作用的保證，葉綠素的降解也是植物葉片衰老的主要標志[20]。在本試驗中，隨油茶樹齡的增加，相同葉齡的油茶葉片中葉綠素含量在古樹中明顯高于壯齡樹和幼樹，這在一定程度上反映出油茶古樹葉片內(nèi)的生命活動更為活躍，且葉片中葉綠素a含量與葉綠素b含量的比值有所增加，這與戚元春等對古樟樹（Cinnamomum camphora）的研究結(jié)果[21]相一致。在小麥的生長過程中，葉片中葉綠素a和葉綠素b含量的比值產(chǎn)生了變化，衰老葉片中葉綠素a含量與葉綠素b含量的比值增加[22]。但關(guān)于古樹中葉綠素含量高于其他樹齡的樹種少有報道，油茶古樹葉片中葉綠素含量高于幼樹的生理機制，尚待進一步研究。

可溶性糖可維持生理代謝反應(yīng)場所的滲透平衡動態(tài)[23]，可溶性蛋白作為各種新陳代謝反應(yīng)的催化劑，也與葉綠素形成色素蛋白復合體，影響植物光合作用。李東林等比較了黃山松不同齡階針葉衰老指標，發(fā)現(xiàn)隨樹齡增加，可溶性蛋白含量與葉綠素含量的變化趨勢呈正相關(guān)關(guān)系[24]。本試驗結(jié)果，二者之間呈負相關(guān)關(guān)系，可能是由于古樹自身存在的自我修復能力，樹勢逐漸增強;油茶古樹中可溶性糖和可溶性蛋白的含量低于壯齡樹和幼樹，而脯氨酸含量在古樹中有所增加，這可能與可溶性糖和可溶性蛋白分解有關(guān)[25-26]，增加的脯氨酸與可溶性蛋白和可溶性糖一同維持葉片細胞滲透壓，保持了內(nèi)生物膜的完整性[27]，延緩植物衰老進程。

脯氨酸同時還是一種抗氧化劑，與SOD、POD、CAT等抗氧化酶協(xié)同作用，清除細胞器產(chǎn)生的H2O2、·OH等活性氧（ROS），緩解ROS對細胞的氧化損壞[28]。植物衰老中積累的ROS對生物體具有毒害效應(yīng)，加速植物的衰老[29-30]。在本試驗中，古樹二年生葉片中SOD活性要明顯強于壯齡樹和幼樹;而POD和CAT活性在古樹不同年齡葉片中均高于壯齡樹和幼樹。由3種酶活性與MDA含量變化的響應(yīng)來看，油茶古樹的MDA含量并沒因樹齡的增加而遠高于壯齡樹和幼樹，H2O2含量的增幅也低于壯齡樹和幼樹，同時表現(xiàn)出較高的SOD、POD、CAT活性，這與古樹葉片內(nèi)抗氧化酶的活性調(diào)節(jié)是密不可分的。MDA和H2O2積累越多表明植物受到活性氧的傷害越大[29-30]，油茶古樹中MDA和H2O2的含量仍處在較低的水平，抗氧化酶有效地清除了植物衰老過程中自身代謝所產(chǎn)生的ROS，古樹依然保持正常生理代謝活動。