劉 慧， 李 博， 牛 林， 邱 林， 王 永*

1湖北工程學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院/特色果蔬質(zhì)量安全控制湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，湖北 孝感 432000； 2華中農(nóng)業(yè) 大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/昆蟲資源利用與害蟲可持續(xù)治理湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070； 3廣州 海關(guān)隸屬南沙海關(guān)，廣東 廣州 511400； 4中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/棉花生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 安陽 455000； 5湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，湖南 長沙 410128

蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis，Bt)屬革蘭氏陽性菌，在芽孢形成時(shí)會(huì)產(chǎn)生具有殺蟲活性的伴孢晶體蛋白，主要分為Cry蛋白和Cyt蛋白2類(Crickmoreetal.,1998)，其中Cry蛋白是最常見的殺蟲蛋白。由于Bt殺蟲蛋白具有比較好的高效性和專一性，被認(rèn)為是良好的化學(xué)農(nóng)藥替代物，表達(dá)Bt蛋白的轉(zhuǎn)基因作物和微生物殺蟲劑也被廣泛應(yīng)用于害蟲防治(Bravoetal.,2011)。由于20世紀(jì)90年代初期棉鈴蟲Helicoverpaarmigera(Hübner)大暴發(fā)，對(duì)我國棉花產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失，對(duì)棉鈴蟲具有高效殺蟲活性的轉(zhuǎn)基因棉花(主要表達(dá)Cry1Ac)首先在我國廣泛種植。轉(zhuǎn)基因作物的種植面積不斷擴(kuò)大，由1997年的170萬hm2增加至2016年的1.85億hm2，其中抗蟲轉(zhuǎn)基因作物高達(dá)41% (ISAAA,2016; Wangetal.,2018))。然而,單一、大面積種植轉(zhuǎn)基因作物增加了棉鈴蟲等靶標(biāo)害蟲的抗性風(fēng)險(xiǎn)，成為Cry蛋白在害蟲防治中可持續(xù)利用的重大威脅(Hagenbucheretal.,2017; Von Kaneletal.,2016)。因此，明確Bt殺蟲蛋白的殺蟲機(jī)制和靶標(biāo)害蟲的抗性機(jī)理，對(duì)于可持續(xù)利用Bt蛋白防治害蟲具有重要意義。

Bt蛋白發(fā)揮殺蟲活性的重要前提是Cry蛋白能夠與昆蟲中腸上皮細(xì)胞刷狀緣膜囊(brush border membrane vesicle,BBMVs)上的受體蛋白結(jié)合(Jurat-Fuentes & Crickmore,2017)。目前已報(bào)道的Cry殺蟲蛋白受體主要包括鈣黏蛋白(cadherin，CAD)、氨肽酶(aminopeptidase N，APN)和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)(Pardo-Lopezetal.,2013; Soberonetal.,2009)。此外，研究發(fā)現(xiàn)，V-ATP合成酶亞基A/B、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ABCC2、ABCC3、ABCG1、ABCA2)和鈉溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)體可與Cry蛋白結(jié)合，可能是潛在的Cry受體蛋白(Chenetal.,2010; Contrerasetal.,2013; Qiuetal.,2017b)。其中，APN作為Cry蛋白的受體功能已在煙草天蛾ManducasextaL.、煙芽夜蛾Heliothisvirescens(Fabricius)、小菜蛾P(guān)lutellaxylostellaL.等鱗翅目昆蟲中得到鑒定(Contrerasetal.,2013; Luoetal.,1997; Wangetal.,2017a)。

當(dāng)前已報(bào)道的Cry基因超過500種，根據(jù)其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和殺蟲活性大致被分為67類 (Crickmoreetal.，2014)。由于不同類別的Bt殺蟲蛋白存在殺蟲特異性，不同殺蟲蛋白對(duì)同一靶標(biāo)害蟲的殺蟲效果不盡相同，同一昆蟲體內(nèi)也可能存在不同的受體蛋白(Frankenhuyzen,2009)。二化螟Chilosuppressalis(Walker)是水稻上的重要害蟲之一(Duetal.,2013)。由于水稻品種更新、氣候變化、水稻耕作技術(shù)發(fā)展以及二化螟抗藥性產(chǎn)生等因素的影響，二化螟在我國的危害程度持續(xù)上升(陳波等,2012)。目前，Cry2A類蛋白的受體鑒定和作用機(jī)制相關(guān)報(bào)道較少，因此，本文在前期獲得二化螟APN1基因的基礎(chǔ)上，分析其與Cry2Aa蛋白的結(jié)合能力，為二化螟APN蛋白的受體功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

二化螟為本實(shí)驗(yàn)室內(nèi)以人工飼料(不含Bt蛋白)連續(xù)飼養(yǎng)多代的敏感種群，未接觸任何殺蟲劑。待幼蟲生長至4齡，將其放置冰上切取中腸，去除內(nèi)含物，用預(yù)冷的0.7%NaCl溶液沖洗并用吸水紙將其吸干，立即放入液氮中冷凍，收集的中腸樣品放入-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

表達(dá)載體pET-28a-(+)、克隆感受態(tài)細(xì)胞Trans l-T1 Phage Resistant為實(shí)驗(yàn)室前期保存。反轉(zhuǎn)錄cDNA合成試劑盒和限制性內(nèi)切酶(EcoRⅠ和NotⅠ)(Fermentas公司)，RNA提取試劑和DNA聚合酶(PrimeSTAR?Max DNA Polymerase)(Takara公司)，T載體peasy-blunt和感受態(tài)細(xì)胞Trans BL21(DE3)(全式金公司)，質(zhì)粒提試劑盒和X-gal[天根生化科技(北京)有限公司]，DNA T4連接酶(Promega公司)、Cry2Aa活化蛋白(美國一龍公司Envirologix Inc.)。菌體破碎時(shí)使用的溶菌酶，PMSF，DNaseI，蛋白純化時(shí)使用的填料(康為世紀(jì)生物科技有限公司)；PTG，硫酸卡那霉素胰蛋白胨，酵母提取物，氯化鈉(武漢鼎國生物技術(shù)有限公司)。PCR引物合成和DNA測(cè)序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。蛋白純化所用的inclusion bingding buffer、inclusion elution buffer為自己配制，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 二化螟中腸RNA的提取及cDNA模板的合成

取10頭二化螟4齡幼蟲的中腸，放入無RNAase的1.5 mL離心管中，加入1000 μL的 Trizol reagent充分勻漿，用Takara公司的RNAiso Plus試劑盒進(jìn)行總RNA的提取，將提取的RNA按照Thermo Scientific cDNA第一鏈合成試劑盒說明書合成cDNA。

1.4 APN1基因片段的克隆

1.4.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中二化螟APN1(JQ747494.1)的序列，在Cry2Aa蛋白結(jié)合區(qū)設(shè)計(jì)引物：APN1正向引物5′-AGGAATTCATGGACGGGATTGCCAAATC-3′，反向引物5′-AGGCGGCCGCTTTCAACATCAAAGCGATCATTGTTG-3′，為了便于將目的基因克隆到表達(dá)載體上，在正向、反向引物中分別設(shè)計(jì)了EcoRⅠ、NotⅠ酶切位點(diǎn)(用下劃線表示)。

1.4.2 PCR產(chǎn)物的克隆和鑒定 以合成的cDNA第一鏈為模板，按照說明書配制Prime STAR Max的PCR體系，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收目的片段。將回收的目的片段連接到克隆載體peasy-blunt中，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，藍(lán)白斑挑選，挑取白色單菌落，培養(yǎng)后進(jìn)行菌液PCR鑒定，將鑒定的陽性克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.5 APN1基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

1.5.1 質(zhì)粒提取 對(duì)測(cè)序正確的單菌落菌液，1∶100加入10 mL帶kana抗性的LB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，采用TIANprep Mini Plasmid Kit進(jìn)行質(zhì)粒提取。

1.5.2 重組表達(dá)載體的構(gòu)建 將重組的質(zhì)粒peasy-blunt/APN1和原核表達(dá)載體pET-30a-(+)經(jīng)EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切后，分別切膠回收1600、5000 bp左右的片段。在T4連接酶的作用下，將APN1片段與原核表達(dá)載體pET-30a-(+)于16 ℃過夜孵育。接著轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，過夜培養(yǎng)，然后進(jìn)行菌液PCR的鑒定及重組質(zhì)粒的測(cè)序鑒定。

1.6 APN1多肽片段誘導(dǎo)表達(dá)并純化

1.6.1 APN1多肽片段誘導(dǎo)表達(dá) 提取經(jīng)鑒定正確的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂平板，過夜培養(yǎng)。挑取單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證，取陽性結(jié)果對(duì)應(yīng)的菌液100 μL加入到10 mL Kana+LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)4 h，再轉(zhuǎn)入1 L Kana+LB液體培養(yǎng)基中，D600 nm值達(dá)到0.5～0.8時(shí)，加IPTG至終濃度為1.0 mmol·L-1， 37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)6 h，12000g離心1 min，棄上清，所得沉淀為總蛋白，用于SDS-PAGE電泳及純化。

1.6.2 APN1多肽片段純化 將IPTG誘導(dǎo)后的蛋白加入LE buffer(100 mmol·L-1NaH2PO4，10 mmol·L-1Tris-HCl，8 mmol·L-1urea，pH8.0)溶解，4 ℃ 18000 r·min-1離心30 min，取上清至His-tag親和層析柱，wash buffer(100 mmol·L-1NaH2PO4，10 mmol·L-11 Tris-HCl，10 mmol·L-1Imidazole，8 mmol·L-1urea，pH8.0)沖洗柱子。elution buffer(100 mmol·L-1NaH2PO4，10 mmol·L-1Tris-HCl，500 mmol·L-1Imidazole，8 mmol·L-1urea，pH8.0)洗脫目的蛋白。收集的純化蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

1.7 ligand bloting分析

將提取純化的APN1片段進(jìn)行SDS-PAGE分析，用Bio-Rad標(biāo)準(zhǔn)半干法轉(zhuǎn)膜裝置將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用PBST稀釋的5%脫脂奶粉封閉2 h，與活化的Cry2Aa殺蟲蛋白(0.3 μg·mL-1)孵育2 h；PBST洗膜10 min，重復(fù)3次；與Cry2Aa的抗體(1∶3500)孵育2 h；PBST洗膜10 min，重復(fù)3次；辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶3500)孵育2 h；ECL化學(xué)發(fā)光顯色，記錄圖片。

2 結(jié)果與分析

2.1 APN1在大腸桿菌表達(dá)純化結(jié)果

結(jié)合GenBank已收錄的APN1的全長，經(jīng)過表達(dá)載體構(gòu)建將目的基因構(gòu)建到pET-30a-(+)表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞以后，用終濃度1 mmol·L-1的IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)并純化。如圖1所示，在體外獲得了二化螟APN1蛋白，誘導(dǎo)表達(dá)和純化得到的蛋白大小一致，約70 Ku，與預(yù)測(cè)的蛋白大小相一致。純化后的多肽條帶單一，純度較好，可以用于蛋白雜交實(shí)驗(yàn)。

圖1 二化螟APN1的原核表達(dá)和純化Fig.1 Prokaryotic expression and purification of C. suppressalis APN11:Marker; 2:未添加IPTG誘導(dǎo)的總蛋白；3:IPTG誘導(dǎo)的總蛋白；4:Ni2+柱純化的蛋白。1: Marker; 2: No IPTG-induced total protein; 3: IPTG-induced total protein; 4: Purified protein by Ni2+ column.

2.2 Cry2Aa蛋白與APN1多肽片段的結(jié)合分析

將純化后的APN1進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，采用ligand bloting技術(shù)，檢驗(yàn)APN1片段和Cry2Aa的結(jié)合能力，結(jié)果如圖2所示，表達(dá)的二化螟APN1多肽片段可以與活化的Cry2Aa殺蟲蛋白結(jié)合，且結(jié)合條帶隨著重組蛋白上樣量的降低而減弱。

圖2 二化螟APN1蛋白與Cry2Aa蛋白的結(jié)合Fig.2 The binding of APN1 protein to Cry2Aa protein in C. suppressalis1:10 μL二化螟APN1蛋白；2:5 μL二化螟APN1蛋白。1: 10 μL of C. suppressalis APN1 protein; 2: 5 μL of C. suppressalis APN1 protein.

3 討論

有關(guān)Cry蛋白的作用機(jī)制，普遍認(rèn)為Cry蛋白被靶標(biāo)昆蟲取食后，在昆蟲中腸堿性環(huán)境條件下溶解，原蛋白在中腸酶的作用下水解為活化的殺蟲蛋白，活化的殺蟲蛋白與昆蟲中腸上皮細(xì)胞BBMVs上的特異性受體相結(jié)合后，經(jīng)過復(fù)雜的相互作用插入到昆蟲細(xì)胞膜的脂筏中，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外離子通透性和滲透壓改變，引起細(xì)胞裂解和幼蟲死亡(Adangetal.,2014; Bravoetal.,2011; Qiuetal.,2017b)。

Cry蛋白發(fā)揮作用的前提是其能夠與昆蟲體內(nèi)的特異性蛋白受體相結(jié)合，這也是Bt蛋白發(fā)揮作用非常關(guān)鍵的一步(Jurat-Fuentes & Crickmore,2017)。目前已報(bào)道可以與Cry蛋白結(jié)合的蛋白中，其中一些已確認(rèn)為Cry蛋白的受體蛋白，一部分可能是潛在的受體蛋白。1995年發(fā)現(xiàn)昆蟲APN為Cry蛋白的結(jié)合蛋白，現(xiàn)已在超過20多種鱗翅目昆蟲中得到證實(shí)(Qiuetal.,2017a)。APN1作為Cry1類蛋白受體已經(jīng)在粉紋夜蛾Trichoplusisni(Hübner)、煙草天蛾、棉鈴蟲和二化螟中得到證實(shí)(Flores-Escobaretal.,2013; Tiewsiri & Wang,2011; Weietal.,2016; Zhangetal.,2009)。Wangetal. (2017b)發(fā)現(xiàn)RNAi敲除APN1基因能降低二化螟對(duì)Cry1Ac的敏感性。但由于不同類型的殺蟲蛋白可能存在不同的受體蛋白，Cry2A與Cry1A類殺蟲蛋白具有不同的作用機(jī)制(Weietal.,2015)。

蛋白質(zhì)結(jié)合是Bt蛋白發(fā)揮殺蟲活性的前提，但結(jié)合并不意味著就是蛋白受體。谷實(shí)夜蛾中APN1是Cry1Ac的受體蛋白，但不是Cry2Ab的受體(Weietal.,2016)。Cry1Ac和Cry2Aa蛋白能夠與南方小花蝽OriussimilisZheng成蟲體內(nèi)的熱激蛋白70相結(jié)合，但實(shí)驗(yàn)確認(rèn)為非特異性結(jié)合(Wangetal.,2018)。肌動(dòng)蛋白actin作為Cry1Ac蛋白的結(jié)合蛋白在煙草天蛾和棉鈴蟲蛋白質(zhì)組中得到鑒定，在埃及伊蚊Aedesaegypti(L.)中也可作為Cry4Ba的結(jié)合蛋白(Bayyareddyetal.,2009)。肌動(dòng)蛋白與Cry蛋白的結(jié)合有可能破壞細(xì)胞骨架的正常功能(Chenetal.,2010; McNall & Adang,2003)，但肌動(dòng)蛋白是否為Cry的受體蛋白至今還未明確。Qiuetal. (2017a)利用RNAi敲除2個(gè)氨基肽酶N基因(APN1和APN2)導(dǎo)致二化螟對(duì)Bt水稻品系TT51(Cry1Ab和Cry1Ac融合基因)和T1C-19(Cry1Ca基因)的敏感性降低，但對(duì)T2A-1品系(Cry2Aa基因)的敏感性無顯著變化。本研究發(fā)現(xiàn)，Cry2Aa殺蟲蛋白可以與原核表達(dá)的二化螟中腸APN1多肽片段結(jié)合，其與Cry2Aa之間的互作關(guān)系仍需進(jìn)一步研究。