楊小穎 胡芳 韋曉虹 HEAN Povkanha 孫遼

中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院內(nèi)分泌與代謝病科（廣東珠海519000）

隨著肥胖和2 型糖尿病等代謝性疾病的流行，非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）也由于其迅速增長的發(fā)病率而備受關(guān)注［1］。NAFLD 的全球性流行可能與人們攝入食物熱量以及靜坐生活方式的增加有關(guān)［2］。NAFLD表現(xiàn)為肝內(nèi)甘油三酯的過度沉積［3］，它是目前最常見的慢性肝臟疾病，可以從單純性脂肪變性發(fā)展成脂肪性肝炎，最終導(dǎo)致肝纖維化、肝硬化甚至肝癌［4］。然而，目前除了飲食控制和運(yùn)動(dòng)所致的體質(zhì)量減輕外，并沒有有效的治療NAFLD 的方法［5］。黃芪甲苷Ⅳ是從黃芪提取物中純化的主要生物活性成分，本課題組前期研究顯示，黃芪甲苷Ⅳ能顯著減輕游離脂肪酸誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積［6］，但黃芪甲苷Ⅳ是否能在體內(nèi)發(fā)揮作用尚未清楚。因此，本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，研究黃芪甲苷Ⅳ對(duì)高脂高糖飲食誘導(dǎo)的NAFLD 小鼠肝臟脂質(zhì)代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 5 周齡雄性C57BL∕6 小鼠40 只，購自廣東省醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心（合格證編號(hào)為：NO.44007200044791），適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后體重為（20.08±1.00）g，所有小鼠分籠喂養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水，12 h 光∕暗周期交替，室溫22～26 ℃。

1.1.2 試劑和儀器 高脂飼料（D12492）購于廣東省醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，普通飼料購自北京華阜康生物科技股份有限公司；黃芪甲苷Ⅳ購自上海研瑾生物科技有限公司。1%羧甲基纖維素（CMC）、果糖和葡萄糖購自上海超研生物科技有限公司；乙醇、二甲苯、氨水購自珠海市香洲諾狄化玻儀器商行，伊紅染色液購自廣州華奇盛生物科技有限公司，蘇木素染色液購自biosharp，中性樹膠購自中國上海懿洋儀器有限公司；油紅O 染料購自廣州捷倍斯生物科技有限公司，甘油明膠購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 高脂高糖飲食誘導(dǎo)NAFLD 小鼠模型及藥物干預(yù) 5 周齡雄性C57BL∕6 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)正常飼料1 周后，隨機(jī)分為正常飲食組（normal diet，control，n= 8）、高脂高糖飲食組（high fat and highsugar diet，HFD，n= 8），高脂高糖飲食+AS-Ⅳ30 mg∕（kg·d）組（HFD+30AS-Ⅳ，n=8），高脂高糖飲食+AS-Ⅳ60 mg∕（kg·d）組（HFD+60AS-Ⅳ，n= 8），高脂高糖飲食+ AS-Ⅳ120 mg∕（kg·d）組（HFD+120AS-Ⅳ，n=8）。正常飲食包含20%kCal 來源于脂肪，60% kCal 來源于蛋白質(zhì)，20% kCal 來源于碳水化合物。高脂飲食主要包含60%kCal 來源于脂肪，20%kCal 來源于蛋白質(zhì)，20%kCal 來源于碳水化合物。高糖飲食是把糖加入飲用水中，以果糖55%、葡萄糖45%的比例配成42 g∕L。AS-Ⅳ用1%CMC 溶解后每日灌胃1 次，灌胃13 周，每周稱量體質(zhì)量、隨機(jī)血糖。13 周后采用1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，用頸椎脫臼法處死小鼠。

1.2.2 H&E 染色觀察肝臟組織切片 新鮮肝臟組織在10%中性甲醛溶液中進(jìn)行固定24 h 后，常規(guī)脫水（梯度酒精：70%、85%、95%、無水乙醇），透明（二甲苯），浸蠟，石蠟包埋，連續(xù)切片，切片厚度4 μm，然后可進(jìn)行HE 染色。切片常規(guī)經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精水化；浸泡于蘇木素3 min，鹽酸酒精分化1 s，氨水返藍(lán)1 min，伊紅酒精浸染3 min，梯度酒精脫水，中性樹膠封片，待膠干后顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.2.3 油紅O 染色觀察肝臟組織切片 新鮮肝臟組織用包埋劑包埋后置于-80 ℃冰箱保存，然后可進(jìn)行連續(xù)切片，切片厚度10 μm，切片置于-20 ℃冰箱保存。染色時(shí)，肝臟冰凍切片室溫回溫，4%多聚甲醛固定10 min，蒸餾水浸洗，洗掉包埋劑；60%異丙醇浸洗2 min，便于著色；油紅O 工作液染色30 min 后，60%異丙醇調(diào)色20 s 左右，調(diào)色結(jié)束后，蒸餾水浸洗，蘇木素染色液復(fù)染30 s，鹽酸酒精分化1 s，最后蒸餾水浸洗2 次，甘油明膠封片，待膠干后顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 20.0 軟件統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠血糖、體質(zhì)量和肝臟濕重的比較圖1A 顯示自第9 周起，HFD組小鼠的隨機(jī)血糖比Control組高（P＜0.05），但AS-Ⅳ并不能降低NAFLD小鼠的隨機(jī)血糖。圖1B-1D 顯示自第3 周起，與Control組相比，HFD組小鼠的體質(zhì)量變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。圖1E 表明HFD組較Control組小鼠的肝臟濕重增加（P＜0.05）。圖中還表明與HFD組相比，用不同濃度的AS-Ⅳ干預(yù)后，小鼠的體質(zhì)量和肝臟濕重并未見明顯變化，其中，HFD+60AS-Ⅳ體質(zhì)量有減輕的趨勢(shì)，該組肝臟濕重也有減少，其余兩組小鼠的體質(zhì)量和肝臟濕重與HFD組相似。這表明AS-Ⅳ濃度為60 mg∕（kg·d）時(shí)，可能減輕非酒精性脂肪肝小鼠的體質(zhì)量和肝臟濕重。

2.2 肝臟組織H&E染色 圖2顯示400×高倍視野下HFD 小鼠較Control組小鼠肝臟脂質(zhì)沉積明顯增多，而給予不同濃度的AS-Ⅳ干預(yù)后，肝臟脂質(zhì)沉積明顯減少，以濃度為60 mg∕（kg·d）的AS-Ⅳ組最明顯。

2.3 肝臟組織油紅O 染色 圖3A 顯示400×高倍視野下的油紅O染色結(jié)果，圖3B是對(duì)油紅O染色結(jié)果的定量分析。從圖中可以看到，Control組小鼠肝臟脂滴形成較少，HFD組小鼠肝臟可見明顯脂滴形成（P＜0.05）；給予不同濃度的AS-Ⅳ干預(yù)后，肝臟脂滴形成明顯減少，以濃度為60 mg∕（kg·d）的AS-Ⅳ組最明顯（P＜0.05）。

圖2 肝臟組織H&E 染色（×400）Fig.2 H&E Staining of Liver Tissues（×400）

3 討論

流行病學(xué)的研究表明，非酒精性脂肪肝目前是全球性健康問題［7］，隨著靜坐方式和高能量物質(zhì)攝入的增加，它的發(fā)病率呈增長趨勢(shì)［8-9］。非酒精性脂肪肝包括從單純性脂肪變性到合并或不合并纖維化的脂肪性肝炎的一系列肝臟損傷［10］，單純性脂肪變性是指肝臟甘油三酯在肝細(xì)胞中的積聚超過5%［11］，它通常是良性的，但可以發(fā)展成脂肪性肝炎，脂肪性肝炎除了肝臟甘油三酯的積聚外，還包括小葉炎癥和肝臟損傷的特征性改變，它最終可以導(dǎo)致肝纖維化、肝硬化甚至肝癌［12］。在過去幾十年里，人們不斷地研究非酒精性脂肪肝的病因、發(fā)病機(jī)制、治療等方面，對(duì)非酒精性脂肪肝也取得了一定的了解。然而，在非酒精性脂肪肝的各個(gè)方面中，治療取得的進(jìn)展最慢［13］，目前仍然沒有有效的治療非酒精性脂肪肝的方法。因此NAFLD 的藥物防治研究近年來成為研究的焦點(diǎn)。從中藥提取物中純化的生物活性化合物更是研究熱點(diǎn)［14］。在中國藥典中，黃芪被描述為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，是一種常用的中草藥［15-16］。根據(jù)《神農(nóng)百草經(jīng)》和《本草綱目》的記載，黃芪治療作用廣泛，歸為滋補(bǔ)藥，被認(rèn)為能提高免疫力、治療糖尿病等［17］。黃芪甲苷Ⅳ是從黃芪提取物中純化的主要生物活性成分，它廣泛用于代謝疾病的中藥治療，作用與黃芪類似［18］。既往研究表明，黃芪能改善2 型糖尿病大鼠的胰島素抵抗和肝臟脂質(zhì)沉積［19］。有文獻(xiàn)報(bào)道，AS-Ⅳ可能通過增加脂肪組織瘦素的敏感性以及調(diào)節(jié)能量代謝，從而有效地改善肥胖小鼠的脂質(zhì)代謝［20］。本課題組在游離脂肪酸誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞和小鼠原代肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積模型中發(fā)現(xiàn)，激活A(yù)MPK 可上調(diào)ACC 和SREBP-1c 的磷酸化水平，抑制SREBP-1 核內(nèi)轉(zhuǎn)移，下調(diào)脂質(zhì)合成基因的mRNA 水平而改善肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積［6］。然而，AS-Ⅳ是否能改善小鼠體內(nèi)的肝臟脂質(zhì)沉積尚未清楚。因此，本研究采用高脂高糖飲食構(gòu)建非酒精性脂肪肝小鼠模型，每日灌胃不同濃度的AS-Ⅳ，從而觀察AS-Ⅳ對(duì)非酒精性脂肪肝小鼠的作用。研究結(jié)果表明AS-Ⅳ能減輕NAFLD 小鼠的肝臟脂滴形成，當(dāng)濃度為60 mg∕kg 時(shí)，AS-Ⅳ的作用最顯著。

圖3 肝臟組織油紅染色（×400）Fig.3 Oil Red O staining of liver tissues（×400）

綜上所述，本研究證實(shí)了AS-Ⅳ能減輕非酒精性脂肪肝小鼠的肝臟脂質(zhì)沉積，但AS-Ⅳ能否通過活化AMPK 來減少肥胖小鼠的肝臟脂質(zhì)沉積，目前尚未清楚，為此我們下一步將進(jìn)行具體的機(jī)制探討。