宋獻(xiàn)美 吳曉東 石科 許波

1河南醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校微生物與免疫教研室（鄭州451191）；2鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院（鄭州兒童醫(yī)院）病理科（鄭州450018）

隨著生活水平的提高，非酒精性脂肪性肝病 （non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）已成為威脅人類健康的重要疾病。流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，NAFLD的發(fā)病率不斷上升且呈現(xiàn)低齡化的趨勢(shì)［1］，且其中10%～15% 的NAFLD 患者最終發(fā)展為肝硬化甚至肝癌［2］。因此，有效的預(yù)防及治療NAFLD 具有重要的意義。微生態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群可通過(guò)“腸-肝循環(huán)”干預(yù)肝病的發(fā)生、發(fā)展，有望成為治療NAFLD 的新手段［3］。目前常用的益生菌大部分必須低溫冷藏保存，而地衣芽孢桿菌耐熱，常溫保存即可，并以芽孢形式通過(guò)高酸胃環(huán)境，到達(dá)腸道后萌發(fā)成活菌發(fā)揮作用［4］。臨床研究表明地衣芽孢桿菌治療NAFLD 療效確切，但其作用機(jī)制不明。本研究通過(guò)NAFLD 大鼠模型，觀察地衣芽孢桿菌對(duì)大鼠肝功能、血脂、肝組織病理學(xué)及小腸中緊密連接蛋白表達(dá)的影響，探討地衣芽孢桿菌治療NAFLD 的作用及機(jī)制，為臨床提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 地衣芽孢桿菌（青島東海藥業(yè)有限公司）；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、二胺氧化酶（DAO）、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；顯色基質(zhì)鱟試劑盒（廈門(mén)鱟試劑生物科技股份有限公司）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA 試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；緊密連接蛋白（Occludin）、閉鎖小帶蛋白-1（ZO-1）多克隆抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；高脂飼料（83.25% 基礎(chǔ)飼料+10% 豬油+1.5%膽固醇+5%蔗糖+0.2%脫氧膽酸鈉+0. 05%丙硫氧嘧啶，江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 模型制備與分組給藥 40 只雄性Wistar 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為4組：正常（Con）對(duì)照組、模型對(duì)照（Mod）組、地衣芽孢桿菌低（BLL，2.5 × 107CFU∕kg）、高劑量（BLH，5.0 × 107CFU∕kg）組，每組10 只大鼠。分組后Con組給予普通飼料喂養(yǎng)，Mod組、BLL、BLH組用高脂飼料喂養(yǎng)建立NAFLD 模型［5］。從第8 周開(kāi)始灌胃相應(yīng)藥物，正常組和模型組灌胃蒸餾水，每天1 次，連續(xù)5周。

1.2.2 生化指標(biāo)測(cè)定 末次給藥后禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，離心分離血清，按照試劑盒說(shuō)明檢測(cè)血清中ALT、AST、TC 和TG 的水平。

1.2.3 肝臟組織病理檢測(cè) 取血后分離大鼠肝臟，在肝右葉離邊緣1 cm 處橫切取肝組織經(jīng)中性甲醛固定，石蠟包埋后切片，常規(guī)HE 染色，于顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)形態(tài)。

1.2.4 血清中ETX、DAO 和肝臟中TNF-α 檢測(cè)采用比色法按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清中DAO 的活性；采用鱟試劑法檢測(cè)血清中ETX的含量；取150 mg 肝組織加450 μL 生理鹽水制備肝勻漿，取勻漿液用ELISA 法檢測(cè)TNF-α的含量。

1.2.5 免疫組織化學(xué)檢測(cè)小腸中Occludin、ZO-1的表達(dá) 分離大鼠小腸組織，中性甲醛固定，脫水、包埋，切片，二甲苯脫蠟后乙醇水化，抗原修復(fù)后分別滴加Occludin、ZO-1 一抗（1：500），SABC 法孵育二抗，DAB 顯色后復(fù)染，顯微鏡下觀察，細(xì)胞胞漿染成棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞。每張切片隨機(jī)取3 個(gè)視野，用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件分析Occludin、ZO-1 免疫反應(yīng)陽(yáng)性的平均光密度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組比較采用單因素方差分析，組間比較用LSD 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生化指標(biāo)結(jié)果 與Con組比較，模型組大鼠血清中各項(xiàng)指標(biāo)水平明顯升高（P＜0.05）。與Mod組比較，BLLL、BLH組大鼠血清ALT、AST 活性明顯降低，TC、TG 含量明顯減少（P＜0.05），且地衣芽孢桿菌實(shí)驗(yàn)組大鼠血清中生化指標(biāo)水平隨著地衣芽孢桿菌劑量的增加而減少。見(jiàn)表1。

表1 大鼠血清中ALT、AST、TC 和TG 的水平Tab.1 The contents of ALT，AST，TC and TG in serum（n=10） ±s

表1 大鼠血清中ALT、AST、TC 和TG 的水平Tab.1 The contents of ALT，AST，TC and TG in serum（n=10） ±s

注：與對(duì)照組比較，*P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05

組別Con Mod BLL BLH ALT（U∕L）44.76±9.13 85.20±18.82*68.21±15.23△59.36±11.90△AST（U∕L）98.35±22.60 176.24±35.39*144.53±29.08△132.84±26.56△TC（mmol∕L）1.46±0.29 3.31±0.86*2.73±0.60△2.25±0.53△TG（mmol∕L）0.58±0.22 1.53±0.43*1.06±0.32△0.84±0.28△

2.2 肝組織病理學(xué) HE 染色顯示，Con組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整清晰，可見(jiàn)呈放射狀排列的肝索，肝細(xì)胞排列整齊，體積正常，界限清楚，無(wú)脂肪變性；Mod組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，小葉內(nèi)肝細(xì)胞腫脹，呈中大泡性脂肪變性，內(nèi)有大小不等的脂滴，小葉內(nèi)可見(jiàn)肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死，匯管區(qū)及小葉內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；BLL、BLH組大鼠肝細(xì)胞腫脹程度減輕，細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量減少，可見(jiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肝索結(jié)構(gòu)明顯改善。見(jiàn)圖1。

2.3 血清中ETX、DAO 和肝中TNF-α 的水平與Con組比較，模型組大鼠血清中各項(xiàng)指標(biāo)水平明顯升高，肝組織中TNF-α 含量增加（P＜0.05）。與Mod組比較，BLL、BLH組大鼠血清ETX、DAO 水平明顯降低，肝組織中TNF-α 含量明顯減少（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

圖1 各組大鼠的肝組織病理（HE，×200）Fig.1 Pathomorphology of liver tissues in NAFLD rats（HE staining，×200）

表2 大鼠血清中ETX、DAO 和肝中TNF-α 的含量Tab.2 The contents of ETX、DAO in serum and TNF-α in liver（n=10） ±s

表2 大鼠血清中ETX、DAO 和肝中TNF-α 的含量Tab.2 The contents of ETX、DAO in serum and TNF-α in liver（n=10） ±s

注：與對(duì)照組比較，*P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05

組別Con Mod BLL BLH ETX（EU∕L）116.03±16.82 212.56±33.61*180.85±28.87△153.72±25.36△DAO（U∕L）3.93±1.40 13.09±3.63*9.89±2.94△7.56±2.15△TNF-α（pg∕mg）2.17±0.40 4.32±0.75*3.30±0.62△2.81±0.55△

2.4 各組大鼠小腸Occludin、ZO-1 蛋白表達(dá)Con組、Mod組、BLL組和BLH組大鼠小腸組織中Occludin的表達(dá)平均光密度分別為0.196 3±0.027 6、0.163 8±0.019 2、0.180 4±0.023 9、0.189 6±0.025 1；Zo-1 的表達(dá)平均光密度分別為0.215 6±0.026 8、0.177 5±0.019 1、0.198 9±0.021 1、0.206 2±0.023 7。Mod組大鼠Occludin、ZO-1 蛋白表達(dá)較Con組明顯減少（P＜0.05），與Mod組比較，BLL組大鼠ZO-1 表達(dá)明顯增加，BLH組大鼠Occludin、ZO-1 蛋白均顯著增加（P＜0.05）。見(jiàn)圖2、3。

圖2 各組大鼠的小腸組織中Occludin 的表達(dá)（×200）Fig.2 The expression of Occludin in small intestine of NAFLD rats（×200）

圖3 各組大鼠的小腸組織中Zo-1 的表達(dá)（×200）Fig.3 The expression of Zo-1 in small intestine of NAFLD rats（×200）

3 討論

隨著人們生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變，NAFLD發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。NAFLD 可能與高脂飲食、胰島素抵抗及遺傳易感性密切相關(guān)，過(guò)多的脂肪在肝臟堆積，而肝細(xì)胞一方面從血液中攝取脂肪酸合成TG，另一方面是以極低密度脂蛋白的形式將TG 轉(zhuǎn)運(yùn)出肝細(xì)胞。不論任何步驟發(fā)生異常都會(huì)引起肝細(xì)胞脂肪合成能力增加和（或）轉(zhuǎn)運(yùn)入血能力降低，從而導(dǎo)致肝內(nèi)脂質(zhì)沉積、肝細(xì)胞脂肪變性，肝細(xì)胞出現(xiàn)炎癥壞死，導(dǎo)致NAFLD 的發(fā)生［6］。本研究采用高脂飲食誘導(dǎo)動(dòng)物模型，結(jié)果顯示高脂飼料喂養(yǎng)大鼠肝組織小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞腫脹，出現(xiàn)脂肪變性，可見(jiàn)肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死，血清TC和TG 水平明顯升高，表明大鼠脂質(zhì)代謝紊亂，NAFLD 疾病模型建立成功。

腸道菌群失調(diào)可能是NAFLD 發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，NAFLD 患者腸存在腸道菌群失調(diào)的現(xiàn)象［7］。腸道中革蘭陰性菌增加，內(nèi)源性乙醇生成增多，內(nèi)源性乙醇誘導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子的分泌，激活巨噬細(xì)胞進(jìn)而引起腸道屏障功能受損，腸黏膜通透性增加［8］。大量?jī)?nèi)毒素易位經(jīng)門(mén)脈系統(tǒng)進(jìn)入肝臟，激活肝臟Kupffer 細(xì)胞，釋放TNF-α等炎性介質(zhì)，引發(fā)炎癥瀑布反應(yīng)，對(duì)肝細(xì)胞形成“二次打擊”，損傷肝細(xì)胞，影響其代謝、分泌功能，引起膽汁分泌障礙。膽汁分泌異常會(huì)影響脂肪的正常代謝，脂肪異常堆積導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪變性，最終形成NAFLD［9］。因此，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡可改善肝功能，阻止NAFLD 的發(fā)生［10］。地衣芽孢桿菌可以造成腸道環(huán)境低氧狀態(tài)，支持腸道內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌群生長(zhǎng)（如雙歧桿菌、乳桿菌、擬桿菌、消化鏈球菌等），同時(shí)低氧環(huán)境會(huì)抑制好氧致病菌，進(jìn)而調(diào)節(jié)腸道菌群的平衡。本研究發(fā)現(xiàn)NAFLD 大鼠血清中內(nèi)毒素水平和肝勻漿中TNF-α含量明顯高于正常大鼠，地衣芽孢桿菌干預(yù)后，NAFLD 大鼠血清中ALT、AST 活性和TC、TG 水平降低，肝組織中TNF-α含量減少，肝組織病理學(xué)損傷明顯改善，表明地衣芽孢桿菌對(duì)非酒精性脂肪肝病具有保護(hù)作用。

腸黏膜的通透性可反映腸道屏障功能。DAO是存在于腸黏膜上層絨毛細(xì)胞胞漿中的內(nèi)酶，腸黏膜損傷后DAO 釋放進(jìn)入血液，導(dǎo)致血液中DAO活性增高。通過(guò)檢測(cè)血清中DAO 活性可間接反映腸道的屏障功能變化［11］。腸道屏障功能是主要由腸道黏膜的機(jī)械屏障、免疫屏障、化學(xué)屏障和生物屏障組成，最重要的是機(jī)械屏障。機(jī)械屏障由上皮細(xì)胞及細(xì)胞間緊密連接構(gòu)成，緊密連接決定了腸黏膜通透性［12］。組成緊密連接的蛋白眾多，其中最重要的是Occludin、Zo-1，Occludin 與胞漿中其他蛋白形成緊密連接的基本結(jié)構(gòu)，調(diào)控細(xì)胞的跨上皮電阻和膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能［13］，Zo-1 則是連接Occludin 與胞內(nèi)骨架的關(guān)鍵分子，對(duì)腸上皮起穩(wěn)定作用［14］。緊密連接蛋白的破壞會(huì)導(dǎo)致腸黏膜通透性增高，使內(nèi)毒素、細(xì)菌等從腸腔移位進(jìn)入血液。本研究發(fā)現(xiàn)NAFLD 大鼠血清中DAO 活性升高，說(shuō)明NAFLD 大鼠腸黏膜通透性增加，腸道屏障受損。地衣芽孢桿菌干預(yù)后，血清中DAO 活性降低，腸道中緊密連接Occludin、Zo-1 表達(dá)增加，表明地衣芽孢桿菌可通過(guò)調(diào)節(jié)緊密連接的表達(dá)改善腸黏膜的通透性，保護(hù)腸道屏障。

綜上所述，地衣芽孢桿菌可增加腸道緊密連接蛋白的表達(dá)，改善腸黏膜的通透性，減少內(nèi)毒素的腸滲漏，緩解肝臟脂肪變性，保護(hù)NAFLD 肝臟功能。本研究的創(chuàng)新之處為基于腸道菌群失調(diào)可能是NAFLD發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，通過(guò)地衣芽孢桿菌糾正腸道菌群紊亂，保護(hù)腸道屏障功能，從而對(duì)NAFLD產(chǎn)生改善作用。由于受條件限制，本研究未觀察地衣芽孢桿菌對(duì)NAFLD 大鼠腸道菌群改變的影響，因此，需要通過(guò)更深入的試驗(yàn)來(lái)解決上述問(wèn)題，為地衣芽孢桿菌治療NAFLD 提供更充分的依據(jù)。