孫 宇,王 茹,顧李霖,李佳林,王會中

(解放軍第305醫(yī)院檢驗科,北京 100017)

脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP)于1971年被美國學者OCKNER等[1]在腸道黏膜中發(fā)現(xiàn)，后續(xù)發(fā)現(xiàn)了多種組織的FABP[2]。心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(h-FABP)主要存在于心肌細胞質(zhì)中，心肌損傷時易于釋放入血。有研究表明，發(fā)生急性冠狀動脈綜合征(下稱“冠脈綜合征”)時，在未發(fā)生缺血、缺氧、壞死時即可檢出h-FABP[3-4]，目前，其已被推薦為冠脈綜合征的聯(lián)合測定指標[5-6]。對h-FABP的檢測目前常用的有膠乳凝集比色法、免疫熒光法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法、金標示蹤法等，國內(nèi)外均有相關(guān)成品試劑用于臨床，但這些方法存在價格昂貴、檢測耗時長且定量不準確等缺點[7]，不適宜基層醫(yī)療機構(gòu)廣泛開展。1980年LEUVERING等[8]利用免疫學反應(yīng)時金顆粒凝聚導致顏色減退的原理，建立了均相溶膠顆粒免疫測定法，成功用于人體絨膜促性腺激素(HCG)的檢測，開啟了膠體金均相免疫檢測用于臨床檢測的開端。程黎明等[9]于2010年報道了采用該技術(shù)用于胱抑素C的定量檢測。膠體金均相免疫反應(yīng)，分析靈敏度優(yōu)于普通均相免疫比濁試劑，且制作工藝相對簡單，原材料來源容易，基于這些優(yōu)勢，本研究建立了一種經(jīng)濟、便捷的h-FABP定量檢測方法，其基本原理是將抗h-FABP抗體用物理吸附方法連接到直徑約 80 nm的膠體金表面，此時在540 nm處有最大光譜吸收峰。當吸附有h-FABP抗體的膠體金在液相中與h-FABP相遇時就會結(jié)合、聚集，在540 nm處吸光度值會降低，降低幅度與被結(jié)合h-FABP的量呈反比；同時，在 660 nm處會出現(xiàn)一個最大吸收峰，峰值與被結(jié)合的h-FABP量呈正比。通過檢測樣本溶液在540、660 nm處吸光度的變化，實現(xiàn)了對溶液中h-FABP水平的測定，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1標本來源與采集 陽性標本取自2016年3-9月本院門診、住院經(jīng)確診為急性心肌梗死(AMI)患者52例。健康對照組標本為本院健康體檢人員，無相關(guān)病史及體征，共50例。收集貝克曼檢測儀檢測結(jié)果為臨界(Cut-off)值標本30份，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2主要試劑與原料 氯金酸、蔗糖、甘氨酸溶液、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉均為國藥化學試劑(分析純)，檸檬酸三鈉為Sigma (分析純)，脫脂奶粉為BD DifcoTM，吐溫-20為西隴化工產(chǎn)品(分析純)，4-羥乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)為Sigma(分析純)等。常規(guī)配制50 mmol/L、pH=7.2～7.4的對苯二甲酸丁二醇酯(PBST)緩沖液；鼠抗人h-FABP多克隆抗體為北京博研生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)(貨號604221C)；收集患者血清配制圍為60 ng/mL的h-FABP校準血清備用。膠體金保存液：50 mmol/L Hepes，20%(w/v)蔗糖，1%(w/v)甘氨酸，1%(w/v)。

1.3主要檢測儀器與試劑 北京利德曼生化股份有限公司h-FABP檢測試劑及標準品、北京普析紫外可見分光光度儀TU1810型、日本日立S-4800電子顯微鏡等。所有試劑均在效期內(nèi)，嚴格按檢測標準操作規(guī)程要求進行操作。

1.4實驗方法

1.4.1膠體金制備 將10 mL 1%(w/v)氯金酸溶液與1 000 mL超純水在玻璃容器內(nèi)混合均勻，并加熱至沸騰。將10 mL 1%(w/v)檸檬酸三鈉溶液快速加入至容器內(nèi)，并保持加熱狀態(tài)。當溶液由淡黃色變?yōu)榧t棕色，再變?yōu)榫萍t色后繼續(xù)保持沸騰加熱20 min后停止加熱。待溶液冷卻至室溫后加超純水補足至1 000 mL，即制得實驗所需膠體金顆粒。

1.4.2標記物制備 取100 mL上述膠體金溶液，置于磁力攪拌器上(200 r/min)。緩慢滴加10% K2CO3溶液，將膠體金pH調(diào)至9.0～9.5，并保持攪拌狀態(tài)。將h-FABP抗體用50 mmol/L、pH 7.2 的PBST緩沖液稀釋至50～100 μg/mL，取一定量稀釋后的抗體緩慢滴加至膠體金溶液中，并保持攪拌狀態(tài)2 h。向膠體金溶液中加入1%(w/v)甘氨酸溶液1 mL和5%(w/v)脫脂奶粉溶液1 mL，保持攪拌狀態(tài)，封閉1 h，轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，4 000 r/min離心30 min，棄上清液，沉淀用20 mL膠體金保存液復(fù)懸，磁力攪拌(300 r/min)2 h。

1.5反應(yīng)體系建立 將標記h-FABP抗體按標記物制備過程進行梯度標記，并用校準血清進行驗證，確定最佳標記量、樣本用量、反應(yīng)體積等。利用建立的反應(yīng)體系，自制標準品建立標準反應(yīng)曲線用于定量檢測血清標本。將校準h-FABP抗原用抗原稀釋液倍比稀釋(空白、1/16、1/8、1/4、1/2、無稀釋分別為0、3.75、7.50、15、30、60 ng/mL)制得檢測膠體金標記物校準品。將標準物各稀釋濃度點分別取5、10、20、30、40 μL作為待檢樣本用量。以100 mL膠體金為標記單位，參照標記物制備步驟進行小樣標記物制備，h-FABP抗體標記量為20、50、100、150、200 μg。反應(yīng)體系見表1。確定最佳校準品用量和最佳標記梯度。

表1 反應(yīng)體系

1.6Cut-off值確定 以利德曼試劑檢測Cut-off值標本30份為樣本，采用建立的反應(yīng)體系及標準曲線，重復(fù)測定2次取均值，30份樣本均值再次取均值作為本檢測體系的Cut-off值。

1.7檢測性能初步驗證 用制備的膠體金試劑檢測臨床樣本值并與利德曼公司檢測方法進行比較，驗證檢測體系的有效性。

1.8統(tǒng)計學處理 采用Excel2007軟件CORREL函數(shù)法計算對照試劑與該實驗方法測定值的相關(guān)系數(shù)(r)；比較膠乳凝集比色法與本實驗方法陽性標本檢出的符合率。

2 結(jié) 果

2.1膠體金顆粒鑒定

2.1.1光譜掃描結(jié)果 將膠體金溶液用去離子水1∶3稀釋，用紫外可見光分光光度計以去離子水調(diào)零，掃描膠體金溶液400～700 nm吸收峰，膠體金溶液在540 nm左右有最大吸收峰。見圖1。

2.1.2電鏡檢測結(jié)果 膠體金顆粒樣本經(jīng)電子顯微鏡檢測，平均顆粒大小(80.4±10.4)nm。見圖2。

圖1 膠體金光譜掃描圖

圖2 膠體金顆粒電鏡檢測結(jié)果

2.2標記量確定 樣本用量與標記量實驗結(jié)果見圖3。比較不同樣本的用量和標記物用量間的關(guān)系，確定標本用量為30 μL，h-FABP抗體選擇標記量為100 μg/100 mL膠體金溶液。

圖3 30 μL標本不同標記量反應(yīng)校準曲線

2.3陽性判定值確定 對利德曼檢測試劑檢測處于Cut-off值的30份標本采用本檢測體系進行重復(fù)測定取平均值以h-FABP≤3.6 ng/mL作為界限值。

表2 2種檢測體系檢測結(jié)果比較

2.4臨床樣本檢測比較 按確定的標記量，分別采用利德曼檢測方法與本實驗檢測體系檢測臨床樣本102例，對照試劑測值與膠體金標記物呈正相關(guān)(r=0.962)，以h-FABP≤3.6 ng/mL作為界限值，2種檢測體系檢測結(jié)果比較見表2。

3 討 論

隨著分析方法自動化、配套試劑商品化，定量免疫分析技術(shù)在臨床實驗室得到越來越廣泛的應(yīng)用，成為診斷疾病、評估療效的重要手段。對目前臨床常用的諸多檢測技術(shù)，大部分需特殊的檢測儀器與試劑，檢測成本高，增加了患者的醫(yī)療費用；但低成本的酶免疫分析與膠體金快速法又無法滿足準確定量的需求。這些存在的問題給基層醫(yī)療機構(gòu)帶來了諸多的不便，迫切需要經(jīng)濟實用、便于開展的檢測方法。且從經(jīng)濟發(fā)展和臨床需求看，免疫診斷技術(shù)的未來發(fā)展也是兩種趨勢，一是簡單化、基層化，該方向適合免疫層析試紙條，如再輔以互聯(lián)網(wǎng)等信息平臺，易于實現(xiàn)個人化、家庭化，但受限于方法學很難精確定量；二是自動化、定量化、低成本化，適合該發(fā)展方向的目前主要有膠乳增強免疫比濁、均相酶免疫和液相膠體金免疫等，隨著相關(guān)試劑性能的不斷改進，很可能會影響發(fā)光免疫目前的主導地位[10]。

膠體金示蹤免疫層析技術(shù)廣泛用于臨床快速檢測中，其方法簡便快捷，費用低廉，但無法滿足規(guī)?；?、高通量檢測要求，液相膠體金免疫比色技術(shù)的誕生解決了固相膠體金免疫技術(shù)的困擾[11-12]。

液相膠體金免疫比色技術(shù)基本原理是不同粒徑、不同顏色的膠體金顆?？膳c抗體等蛋白分子非共價結(jié)合，包被后的膠體金顆粒與待測樣本中的抗原發(fā)生凝集反應(yīng)后在特定波長發(fā)生吸光度變化，其變化程度與抗原量成正比，借助普通自動生化分析儀即可準確定量[13]。該方法具備了膠乳增強比濁的反應(yīng)模式，其靈敏度、線性范圍均優(yōu)于膠乳增強免疫比濁法，且制作工藝相對簡單，不受原材料的限制，具備較好的推廣應(yīng)用基礎(chǔ)。

膠體金均相免疫反應(yīng)中抗原抗體反應(yīng)后在540 nm吸光度降低，同時在660 nm吸光度升高，其分析靈敏度比普通均相比濁法高[12-14]。另外，膠體金均相免疫比色技術(shù)減少了免疫反應(yīng)中的中間洗滌步驟，與免疫發(fā)光方法比較，提高了檢測效率，降低了檢測成本，便于基層醫(yī)院開展[15]。

膠體金均相檢測技術(shù)克服了固相膠體金、免疫熒光層析技術(shù)無法準確定量、無法實現(xiàn)高通量檢測要求的缺點[12]，研發(fā)相對容易，材料成本低，綜合多方面的優(yōu)勢，其在實現(xiàn)定量檢測分析中擁有較大的應(yīng)用前景。

近年來，h-FABP已與肌紅蛋白、肌鈣蛋白t/i、肌酸激脢被推薦為AMI聯(lián)合檢測的指標，其在血液中出現(xiàn)時限早(<1 h)，靈敏度和特異度高，對早期AMI尤其具有診斷價值[16-19]。

針對h-FABP的檢測方法很多，但采用膠體金均相免疫檢測技術(shù)的方法尚未見相關(guān)文獻報道。本研究采用膠體金均相免疫技術(shù)初步建立了h-FABP膠體金均相法比色檢測體系，在臨床標本的檢測分析中與成熟的化學發(fā)光法呈正相關(guān)(r=0.962)，以h-FABP≤3.6 ng/mL作為界限值，符合率達95.09%。未能達到膠乳均相免疫檢測方法的檢出能力原因考慮為檢測體系尚不夠完善、制備的試劑組分與配比尚未完全達到臨床分析的要求、實驗過程均為手工操作、誤差較大等多種因素。隨著后續(xù)檢測體系的不斷完善，檢測的靈敏度與準確度會得到進一步的改進與提高。

4 結(jié) 論

通過系列研究與實驗驗證，確立了膠體金試劑制備的基本工藝與流程，初步完成了反應(yīng)體系與反應(yīng)條件的建立，與成熟試劑檢測結(jié)果具有較好的符合率?？傮w而言，達到了預(yù)期目的，初步建立的h-FABP膠體金均相免疫比色法方法學簡便，成本低廉，可實現(xiàn)生化分析儀的高通量快速分析，節(jié)約了大量的儀器與試劑成本，有利于在基層醫(yī)院開展，在臨床標本的定量分析中具有較大的應(yīng)用前景。